沉默bmi-1基因对cd44鼻咽癌类肿瘤干细胞生物学特性的影响-effect of silencing bmi - 1 gene on biological characteristics of cd44 nasopharyngeal carcinoma-like stem cells.docxVIP

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2018-09-08 发布于上海
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沉默bmi-1基因对cd44鼻咽癌类肿瘤干细胞生物学特性的影响-effect of silencing bmi - 1 gene on biological characteristics of cd44 nasopharyngeal carcinoma-like stem cells

三峡大学硕士学位论文三峡大学硕士学位论文 PAGE IV PAGE IV 万方数据 III万方数据 III 万方数据内容摘要目的：探讨 RNA 干扰技术沉默 Bmi-1 基因对 CD44+ 鼻咽癌类肿瘤干细胞生物学特性包括增殖、成球、分化、克隆形成、迁移、侵袭、细胞周期分布、体内致瘤能力和化疗敏感性的影响及其作用机制研究。方法：（1）设计、合成并构建针对Bmi-1基因序列特异性的短发卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒（LV-Bmi-1shRNA），感染通过流式细胞仪分选出的 CD44+ 鼻咽癌类肿瘤干细胞，同时设置空载体组和空白对照组。（2）利用荧光显微镜及流式细胞仪观察并检测感染效率，荧光实时定量PCR及Western blot 方法检测感染前后细胞Bmi-1及其下游基因p16INK4a、p14ARF mRNA 与BMI-1、P16INK4a、P14ARF及 P53蛋白的表达情况。（3）采用CCK-8增殖实验检测LV-Bmi-1shRNA对人CD44+ 鼻咽癌类肿瘤干细胞增殖的作用；成球实验检测沉默Bmi-1基因前后细胞的成球能力；划痕实验、Transwell小室基质迁移及侵袭实验，观察Bmi-1基因表达沉默后对CD44+ 鼻咽癌类肿瘤干细胞迁移与侵袭能力的影响；平板克隆形成实验及MTT比色法检测感染前后细胞的克隆形成能力及对化疗药物5-FU及顺铂的敏感性；流式细胞仪分析各组细胞周期分布；裸鼠皮下移植检测细胞体内致瘤能力，并采用免疫组织化学技术检测瘤体组织中CD44的表达情况。结果：（1）鼻咽癌SUNE-1 5-8F细胞中CD44+ 细胞所占的比例大约为52.4%（32% ~53%）；（2）将构建好的LV-Bmi-1shRNA成功感染入CD44+ 鼻咽癌类肿瘤干细胞，感染效率达95% 以上。（3）LV-Bmi-1shRNA感染有效地抑制了CD44+ 鼻咽癌类肿瘤干细胞中Bmi-1基因mRNA和蛋白的表达水平（P0.05），而其下游基因p16INK4a、p14ARF mRNA 与P16INK4a、P14ARF及P53蛋白的表达则上调。（4）与空载体组、空白对照组相比，LV-Bmi-1shRNA感染组细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭、成球和致瘤能力明显受到抑制；G0/G1期细胞比例增加，G2/M及S期比例降低；对5-FU及顺铂的敏感性增加；（5）未感染细胞及空载体组细胞可在裸鼠体内形成肿瘤，且瘤体组织中CD44 呈阳性（+++）表达，而CD44-鼻咽癌细胞和LV-Bmi-1shRNA感染组细胞则不能在裸鼠体内形成肿瘤。结论：（1）CD44+ 鼻咽癌细胞的体内致瘤能力强于 CD44- 鼻咽癌细胞，并具有分化的能力，呈现干细胞样特性；（2）LV-Bmi-1shRNA 感染能有效地抑制 Bmi-1 基因 mRNA 和蛋白的表达；（3）LV-Bmi-1shRNA 介导的 Bmi-1 基因沉默能抑制 CD44+ 鼻咽癌类肿瘤干细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭及成球与体内致瘤能力，使细胞周期发生阻滞，并使其对化疗药物 5-FU 及顺铂的敏感性增加。而其作用机制可能是通过 Bmi-1-P16INK4a/P14ARF-P53 通路介导的。表明 Bmi-1 基因的表达可能对 CD44+ 鼻咽癌类肿瘤干细胞干细胞样特性的维持有着重要作用，并由此可能成为鼻咽癌治疗的一个潜在的新靶点。关键词：Bmi-1基因 CD44 鼻咽癌类肿瘤干细胞三峡大学硕士学位论文三峡大学硕士学位论文 PAGE IV PAGE IV 万方数据万方数据万方数据 Abstract Objective To investigate the effect of shRNA-mediated silencing of Bmi-1 gene expression on biological characteristics of CD44+ nasopharyngeal carcinoma cancer stem cell-like cells (CSC-LCs) and its potential mechanism. Methods The sequence-specific short hairpin RNA lentivirus targeting at human Bmi-1 gene (LV-Bmi-1shRNA) were designed, synthesized and constructed, which were used to infect CD44+ nasopharyngeal carcinoma CSC-LCs