重组腺病毒介导nk4对人多发性骨髓瘤rpmi8226细胞生物学行为影响-effect of recombinant adenovirus mediated nk4 on biological behavior of human multiple myeloma rpmi 8226 cell.docxVIP

万方数据 Effect of recombinant adenovirus mediated NK4 on the biological behaviors in human multiply myeloma RPMI8226 cells Department of Hematology and Rheumatology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University Ph.D candidate: Que Wenzhong Advisor：Prof Chen Junmin 5 重组腺病毒介导 NK4 对人多发性骨髓瘤 RPMI8226 细胞生物学行为的影响 中文摘要 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）是一种多功能的蛋白。c-Met 为HGF的受体，是一种原癌基因的蛋白产物。它是一种具有生长因子受体结构和 功能性质的跨膜酪氨酸激酶。一旦结合至其配体，该受体发生自我磷酸化可刺激 其内在的酪氨酸激酶活性，从而引起细胞的迁移、增殖和侵袭等行为的改变。已 在多种人类的肿瘤中发现c-Met基因的过表达。HGF/c-Met通路已被证实影响着许 多恶性肿瘤的发生和发展。在骨髓瘤病人的血清和骨髓中发现HGF浓度明显高于 正常人，并且发现这跟病人的预后呈明显的负相关。之前有研究显示，c-Met及 其配体HGF在多株骨髓瘤细胞系和原代骨髓瘤细胞中高表达。此外，有研究指出 HGF可促进骨髓瘤细胞的增殖和迁移。 综上，我们推测阻断HGF/c-Met信号通路也许对多发性骨髓瘤的治疗具有重 要的意义。NK4是一种HGF的拮抗剂，由N末端的发夹结构和4个kringle结构域组 成。NK4一旦结合至c-MET上，可竞争性拮抗HGF所诱导的c-MET酪氨酸磷酸化 作用，从而抑制HGF所介导的细胞增殖、迁移和侵袭。此外，NK4还具有抑制成 纤维细胞生长因子（BFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）所诱导的血管生成 作用。NK4除了HGF拮抗活性外的抗血管生成活性可能与其结构类似血管抑制生 长因子的4个kringle结构域有关。NK4这种具有抑制肿瘤细胞和肿瘤血管生成的 多重功能，暗示了其在多发性骨髓瘤患者治疗的潜在价值。在本课题，我们初步 探讨了Ad-NK4对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226生物学行为的影响及可能的机 制，旨在为NK4在多发性骨髓瘤治疗中的潜在临床应用提供理论基础和实验依 据。 6 第一部分 利用 Gateway 技术构建重组腺病毒 pAd-NK4 研究目的:利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子（HGF）NK4基因的重组腺 病毒载体。研究方法: 以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因，将 回收的NK4 PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒 pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上，利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达 框 转 移 至 腺 病 毒 骨 架 质 粒 pAD/BL-DEST ， 获 得 重 组 腺 病 毒 质 粒 pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞获得重组腺病毒 rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID 50 （Tissue cell infectious dosage 50，TCID 50） 法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显 微镜观察转染效果。 研究结果: 证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段； 病毒滴度为6.3×108 PFU/ml；荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高 效的表达。 结论: 利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色 荧光的重组腺病毒，为下一步开展关于NK4 基因的肿瘤治疗提供了基础。 第二部分 Ad-NK4 对人多发性骨髓瘤 RPMI8226 细胞增殖的影响 研究目的:观察 Ad-NK4 对人多发性骨髓瘤 RPMI8226 细胞增殖的影响及可能机 制。 研究方法: 1. Western blot 和 RT-PCR 检测在转染 Ad-NK4 的 RPMI8226 细 胞中 NK4 的表达。 2.MTT 法体外观察 Ad-NK4 对 RPMI8226 细胞增殖抑制作 用。 3. PI 单染流式细胞仪检测 Ad-NK4 对 RPMI8226 细胞凋亡发生率的影响。 4. DNA 琼脂糖凝胶电泳实验验证 Ad-NK4 对 RPMI8226 细胞的诱导凋亡作用。 5. Western blot 检测 Akt/mTOR 通路主要执行蛋白、细胞周期调控蛋白及细胞凋 亡相关蛋白的表达。 研究