《食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定》（征求意见稿）.doc

GB ××××—2009 GB 5413.14—xxxx PAGE GB 5413.14— GB 5413.14—xxxx 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准食品中维生素B12的测定（征求意见稿）201x-xx-xx实施201x-xx-xx发布中华人民共和国卫生部 发布 食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定 （征求意见稿） 201x-xx-xx实施 201x-xx-xx发布 中华人民共和国卫生部 发布 2010-06-01实施 2010-××-××发布 PAGE \* MERGEFORMAT 4 前 言 本标准代替 GB 5413.14-2010《婴幼儿食品和乳品中维生素B12 的测定》。 本标准与 GB 5413.14-2010相比较，主要变化如下： —— 增加了液相色谱-串联质谱法； —— 增加了免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法； —— 增加了固相萃取-在线柱切换高效液相色谱法。 食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定 范围 本标准规定了液相色谱-串联质谱法、免疫亲和柱层析净化液相色谱法、固相萃取-在线柱切换高效液相色谱法和微生物法测定维生素B12（以下简称VB12）的方法。 本标准第一法、第二法适用于配方奶粉、配方米粉和强化VB12的饮料中VB12含量的测定，第三法适用于配方奶粉、配方米粉中VB12含量的测定，第四法适用于天然食品和强化食品中VB12的测定。 第一法 液相色谱-串联质谱法 原理 试样用乙酸钠缓冲溶液溶解，加入蛋白酶和淀粉酶在37 ℃下酶解；用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等）转化为较稳定的氰钴胺素。样液通过免疫亲和固相萃取柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离、电喷雾离子源离子化、多反应离子监测（MRM）、 试剂和溶液 注：除非另有规定，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1乙酸钠（CH3COONa）。 3.1.2 氢氧化钠（NaOH）。 3.1.3 乙酸（CH3COOH）。 3.1.4 乙腈（CH3CN，色谱纯）。 3.1.5 乙酸铵（CH3COONH4，色谱纯）。 3.1.6 氰化钾或氰化钠（KCN/NaCN）。 3.1.7 胃蛋白酶（活力，38 U/mg）。 3.1.8 Taka-淀粉酶（活力，135 U/mg）。 3.1.9 氮气（N2，纯度 ≥ 99.9 %）。 3.2 试剂配制 3.2.1乙酸钠缓冲液（50 mmol/L）：称取 4.1 g无水乙酸钠，用950 mL水溶解，用乙酸调pH至 4.0 ±0.1后用水定容至1000 mL。 3.2.2 氰化钾（或氰化钠）溶液注1.1（1 mg/mL）：称取 0.1 g 氰化钾（或氰化钠）固体，用水溶解并定容至100 mL。 注1.1：NaCN 和 KCN 为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行 NaCN / KCN 溶液的配制或使用。 3.2.3 氢氧化钠水溶液（1 mol/L）：称取4.0 g氢氧化钠用水溶解并定容至100 mL。 3.2.4 乙酸铵水溶液（2.5 mmol/L）：称取0.19 g乙酸铵用水溶解并定容至1000 mL。 3.2.5 乙腈水溶液（90%，体积比）：分别量取100 mL水、900 mL乙腈混匀，超声脱气。 3.3 标准品 3.3.1 VB12标准品（C63H88CoN14O14P，纯度≥99%）。 3.3.2 同位素标准（13C7-VB12）溶液（1 μg/mL） 3.4 标准溶液配制 3.4.1 标准储备液（1 mg/mL）：用烧杯称取10 mg（精确至0.01 mg） VB12标准品，用水溶解后，移至10 mL容量瓶中，定容至刻度。溶液转移至试剂瓶后，在4 ℃ 3.4.2 标准工作液（100 ng/mL）：准确吸取10 μL标准储备液定容至100 mL，在4 ℃ 3.4.3 同位素内标工作液：取VB12同位素内标溶液0.5 mL（1 μg/mL），用水稀释至10 mL，此溶液浓度为50 ng /mL。在4 ℃下避光保存 3.4.4 标准系列工作溶液：分别准确移取标准工作液5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、80 μL、100 μL、200 μL，并同时分别加入20 μL同位素内标溶液（3.4.3）用水定容至1 mL。其浓度分别为：0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、8 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，同位素内标浓度为1 ng/mL。此标准系列溶液使用前配制。 仪器和设备 4.1 天平：感量0.01 g、0.001 g和0.00001 g。 4.2 pH 计：精度0.01。 4.3