蜱类携带粒细胞无形体的检测方法 征求意见稿.docVIP

×× ××××—×××× PAGE II PAGE 1 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布××××-××-××实施××××-×× 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 ××××-××-××实施 ××××-××-××发布 蜱类携带粒细胞无形体的检测方法 Detecting method for Anaplasma phagocytophilum in ticks （征求意见稿） SN/T ××××—×××× SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T ××××—×××× PAGE 2 前 言 本标准根据GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局、四川出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：宋锋林、樊学军、高玉峰、王有、程晓兰、姜陆、薛芳、吴刚、刘洪文。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 蜱类携带粒细胞无形体的检测方法 1 范围 本标准规定了国境口岸蜱类携带粒细胞无形体的检测对象、生物安全要求、样品采集及保存运输、检测方法和结果判断。 本标准适用于国境口岸蜱类携带粒细胞无形体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部，2006年） SN/T 1293-2003 国境口岸蜱类监测规程 SN/T 1432-2004 入出境列车医学媒介生物监测规程 SN/T 1553-2005 入出境航空器医学媒介生物监测规程 SN/T 1560-2005 入出境船舶医学媒介生物监测规程 SN/T 1596-2005 入出境车辆医学媒介生物监测规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蜱 Tick 蜱属蜱螨亚纲的寄螨目（Parasitiformes）、蜱总科(Ixodidea)。成虫在躯体背面有壳质化较强的盾板，统称为硬蜱（hard tick），属硬蜱科(Ixodidae)；背面无盾板者，统称为软蜱（soft tick），属软蜱科(Argasidae)。 3.2 粒细胞无形体 Anaplasma phagocytophilum 粒细胞无形体是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，属于立克次体目、无形体科，主要通过硬蜱叮咬传播，可引起人粒细胞无形体病。 4 检测对象 ——出入境交通工具、集装箱、货物等场所采集的游离蜱或从上述场所宿主体表采集的寄生蜱； ——口岸地区采集的游离蜱或从上述地区宿主体表采集的寄生蜱。 5 生物安全要求 实验室生物安全要求参照GB 19489及《人间传染的病原微生物名录》（中华人民共和国卫生部，2006年）的规定执行。 6 器材与试剂 6.1 器材 高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、PCR扩增仪、烘箱、水浴锅、生物安全柜、匀浆器、移液器、PCR反应管、冻存管、离心管、塑料平皿、镊子等。 6.2 试剂 氯仿、外引物OUT-1及OUT-2、内引物IN-1及IN-2、10×PCR Buffer（含Mg2+）、dNTPs、DNA Polymerase、ddH2O、基因组DNA提取试剂盒等。 7 蜱类的采集及保存运输 7.1 采集 蜱类采集参照下列标准执行。在采集过程中做好个人防护，防止被蜱类叮咬。 《国境口岸蜱类监测规程》（SN/T 1293-2003）、《入出境列车医学媒介生物监测规程》（SN/T 1432-2004）、《入出境航空器医学媒介生物监测规程》（SN/T 1553-2005）、《入出境船舶医学媒介生物监测规程》（SN/T 1560-2005）以及《入出境车辆医学媒介生物监测规程》（SN/T 1596-2005）。 7.2 分装 将采集的蜱类现场分拣，按类别装入适当的容器（如冻存管、离心管、塑料平皿等），加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点（生境）、采集人、宿主等。 7.3 保存运输 分装完毕的蜱类样品，尽快装入适当的冷冻、冷藏或常温装置，尽早送实验室进行分类鉴定和粒细胞无形体检测。 运送过程中防止蜱类叮咬和逃逸。 8 样品的检测 8.1 基因组DNA提取 使用Universal Genomic DNA Extraction Kit※ 进行基因组DNA提取，也可使用达同等效果的基因组DNA提取试剂盒，提取方法如下： 8.1.1 取蜱类个体放入1.5 mL离心管内，加入650 μL Solution A和0.9μL RN