反义RNA的应用机制及其 人工合成构建反义RNA.docVIP

反义RNA人工合成构建反义RNA随着分子生物学和遗传工程的发展，基因治疗应运而生，反义技术是其中一种，它的基础是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达，包括反义RNA、反义DNA及核酶（Ribozyme），它们通过人工合成和生物合成获得反义RNA，最早是在E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的是指与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式。近几年来通过人工合成反义RNA的基因, 并将其导入细胞内转录成反义RNA, 即能抑制某特定基因的表达,阻断该基因的功能, 有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ 降解；Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。?细胞中反义RNA的来源有两种途径第一是反向转录的产物，在多数情况下, 反义RNA是特定靶基因互补链反向转录产物, 即产生mRNA和反义RNA的DNA是同一区段的互补链。第二种来源是不同基因产物，如OMPF基因是大肠杆菌的膜蛋白基因，与透性有关，其反义基因MICFZE则为另一基因。 　 　Zamecnik和Stephenson于1978年发现了寡聚脱氧核苷酸可作为反义试剂抑制病毒在培养的细胞中的复制。从那时起，反义技术就开始做为药物靶标确认和疾病治疗的有力工具在发展。利用反义技术研制的药物称反义药物。反义药物作用于产生蛋白的基因，因此可广泛应用于多种疾病的治疗，如传染病、炎症、心血管疾病及肿瘤等。与传统药物比较反义药物更具选择性及效率，因此也更高效低毒。基于上述特点反义药物已成为药物研究和开发的热点。而且反义技术还可以应用于生物科学的基础研究从理论上来讲，反义分子可用于治疗任何由基因表达或者基因缺失引起的疾病，比如病毒感染、癌症和炎症。尽管反义技术在理论上相当完美，但是在实际应用中还面临着挑战。图对比了反义技术与传统药物的区别。传统药物大多与蛋白质结合，从而修饰蛋白质的功能。相比之下，反义试剂在mRNA水平上发挥作用，阻止其翻译成蛋白质。反义寡聚核苷酸（AS-ONs，antisense-oligonucleotides）与互补的mRNA配对，而核酶和脱氧核酶具有催化活性，不仅可以与靶RNA结合，还将其切割。最近几年来，新的用于保护寡聚核苷酸免遭酶解、提高靶标亲和性的化学修饰技术的发展，使得反义技术也获得巨大进步。另外，RNA干扰（RNA interference）成为第三代抑制哺乳动物细胞基因表达的高效方法反义寡聚核苷酸（Antisense-oligonucleotides ，AS-ONs）通常由15-20个核苷酸组成，与靶mRNA互补。如图所示，两个机制关系到寡聚核苷酸的反义活性。一是对反义寡聚核苷酸的设计可以激活RNaseH，该酶可以切割DNA·RNA杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解。另外，不能激活RNaseH活性的反义寡聚核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译，因为当反义寡聚核苷酸结合到核酸的5端时，翻译复合物的结合和聚集会被阻止。此外，反义寡聚核苷酸还可以被用来纠正错误的剪接。既然反义RNA在原核生物中对基因表达起着重要的调控作用，那人工设计在天然状态下不存在的反义RNA来调节靶基因的表达也是可能的。这已在不少实验中得到证实。由于目前对靶mRNA的SD序列的上游区的结构了解甚少，因此，在要设计类反义RNA用于和靶mRNASD序列上游区结合，以期达到调节该mRNA翻译的目的是比较困难的。类反义RNA是和mRNA的起始处结合而形成类似ρ-不依赖性的转录终止子而使转录水平上抑制靶基因的表达。因此，要设法在靶mRNA上找到一段连续的U序列，就可以设计出反义RNA，与该U序列上游的mRNA链互补，以形成ρ-不依赖性终止子。理想的作用位点是在靶mRNA的5端上游的非编码区，以免受核糖体的影响。只要靶基因的核苷酸顺序已经知道，就可以人工设计出类反义RNA。有时还可设计同时具有类和类反义RNA功能的反义RNA。 我们还可以设计出天然存在的反义RNA的反义RNA来。这样就可以拮抗原始反义RNA对靶mRNA的抑制作用。而达到激活或加强某个靶基因的表达的目的。然而并不是所有的mRNA对其相应的类反义RNA都敏感。例如，有的mRNA寿命很短，只有1-2分钟，它们和反义RNA结合的机会较少，因