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用于细胞三维培养集成微柱阵列微流控芯片设计与验证 　　摘 要 设计并验证了一种用于细胞三维培养的集成微柱阵列的微流控芯片。芯片由一片聚二甲基硅氧烷（PDMS）沟道片和一片玻璃盖片组成， 在PDMS沟道片上集成了一个由两排微柱阵列围成的细胞培养室和两条用于输送培养基的侧沟道。微柱间距直接影响了芯片的使用性能， 是整个芯片设计的关键。基于数值模拟和实验验证， 本研究对微柱间距进行了优化设计。优化后的微流控芯片可以很好地实现细胞与细胞外基质模拟材料混合液的稳定注入、培养基中营养物质向培养室内的快速扩散和细胞代谢物的及时排出。在芯片上进行了神经干细胞的三维培养， 证明了芯片上构建的细胞体外微环境的稳定性。 　　关键词 微流控芯片； 细胞； 三维培养； 微柱； 聚二甲基硅氧烷 　　1 引 言 　　微流控芯片具有试剂消耗量少、易于精确控制液体流动和模拟构建细胞体外微环境等优点， 在细胞分析领域得到了广泛应用[1～3]。近年来， 基于微流控芯片的细胞分析研究主要包括：单细胞操控与分析[4]、细胞与细胞[5]及细胞与细胞外基质的相互作用[6]、干细胞诱导与分化[7]、药物筛选[8]和器官芯片[9]等， 而细胞培养是开展上述研究的基础。 　　微流控芯片上的细胞培养有二维和三维两种方式。二维培养操作简单， 但最近研究表明， 细胞在二维培养环境中无法真实体现其在体内的生物学特性和功能[10]。在微流控芯片上进行细胞三维培养的主要方法是将细胞与细胞外基质模拟材料（例如胶原蛋白）混合， 然后将混合液注入到细胞培养室中， 为细胞搭建一个三维培养空间， 通过微沟道与培养室连接， 为细胞持续提供培养基[5，11]。 　　芯片上的细胞培养室多数采用一种四周封闭、只有一个入口和一个出口的圆池形结构[12]。这种结构虽然制作简单， 但能够实现的功能有限， 而且在输送培养基时会产生较大剪切力， 对细胞造成伤害[13]。Toh等[14]提出了一种由两排微柱阵列围成的培养室结构， 这种结构既可实现多种复杂功能， 又避免了培养基直接从细胞表面流过， 可大幅减小细胞所受的剪切力， 此种培养室得到了越来越多应用[15]。然而， 有关此类型芯片的优化设计却鲜见报道。微柱间距直接影响芯片使用性能， 间距过大， 在注入细胞与细胞外基质模拟材料混合液时， 混合液会克服流动阻力流出培养室， 使得芯片无法正常工作； 间距过小， 既会增加芯片制作难度， 又会降低培养基中的营养物质和细胞代谢物的扩散速度， 影响细胞正常生长[16，17]。 　　本研究基于数值模拟和实验验证， 对微流控芯片上的微柱间距进行了优化设计， 并在优化后的芯片上进行了神经干细胞三维培养， 检测了构建的细胞体外微环境稳定性。 　　2 实验部分 　　2.1 微流控芯片设计 　　微流控芯片结构如图1所示， 由一片聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）沟道片（40 mm×20 mm×3 mm）和一片玻璃盖片（50 mm×24 mm×0.15 mm）组成。在沟道片上， 集成了一个由两排微柱阵列围成的细胞培养室、两条用于输送培养基的侧沟道和6个储液池。微柱阵列长20 mm， 两排微柱之间距离为1 mm， 微柱直径为100 μm、高150 μm。侧沟道宽1 mm、深150 μm， 储液池直径为3 mm。 　　本研究组曾利用鼠尾I型胶原构建了神经干细胞的三维培养微环境[18]， 因此本研究所用细胞外基质模拟材料均为鼠尾I型胶原。芯片操作流程如下：首先利用移液器将细胞与胶原混合液从细胞入口注入培养室， 接着将芯片放入细胞培养箱中使胶原溶液聚合形成水凝胶， 然后采用微量注射泵将培养基从两个培养基入口注入侧沟道， 培养基中的营养物质通过扩散方式经过微柱阵列进入培养室， 同时细胞代谢物也通过扩散方式排出培养室。 　　2.2 微流控芯片数值模拟 　　基于计算流体动力学， 对不同微柱间距情况下胶原溶液的注入过程和培养基中营养物质的扩散过程进行了数值模拟。 　　首先， 基于COMSOL Multiphysics的两相流水平集模型， 模拟胶原溶液注入过程。由于侧沟道和培养室沿着芯片水平中心线对称分布， 而且微柱等间距排列， 因此为减少仿真工作量， 建立了一个简化的轴对称二维几何模型（图2A）。 　　影响细胞与胶原混合液注入过程的主要参数包括：混合液粘度和表面张力系数、注入压力、微沟道表面接触角、微柱间距等。胶原溶液浓度为1 mg/mL， 利用流变仪测得的粘度为0.032 Pa?s， 利用接触角测量仪测得的表面张力系数为44 mN/m。混合液注入压力设定为1 kPa， 由于微沟道出口与外界大气相通， 因此出口压力设定为0。为了提高芯片键合强度和微沟道表面亲水性， 在芯片键合前， 利用等离子