硫化氢对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织BDNF及TrkB表达影响.docVIP

硫化氢对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织BDNF及TrkB表达影响 　　【摘要】目的：观察硫化氢（H2S）对脑缺血-再灌注损伤大鼠缺血皮层脑源性神经营养因子（BDNF）和酪氨酸激酶B（TrkB）表达的影响。方法：采用线栓法建立SD雄性大鼠缺血-再灌注损伤模型，缺血2 h再灌注72 h。H2S供体硫氢化钠（NaHS）（10、50和100 μmol/kg）再灌注前30分钟腹腔注射。采用实时定量PCR和Western blot检测BDNF和TrkB表达。结果：与假手术组比较，缺血-再灌注组大鼠脑梗死皮层BDNF和TrkB 的表达显著增加（P﹤0.05），而50和100 μmol/kg NaHS处理逆转了上述改变（均P﹤0.05）。结论：H2S上调了脑缺血-再灌注损伤大鼠皮层中BDNF和 TrkB的表达。 　　【关键词】硫化氢；脑缺血-再灌注；脑源性神经生长因子；酪氨酸激酶B 　　【中图分类号】R743 【文献标识码】A 　　硫化氢（hydrogen sulfide， H2S）是一种有臭鸡蛋气味的气体，被认为是第三种气体信号分子，广泛分布于心血管、内脏和神经系统等，参与了多种疾病的发生发展[1]。H2S能清除神经系统内氧自由基、减少脂质过氧化，从而保护神经元[2]。因此本研究拟观察H2S 供体硫氢化钠（sodiumhydrosulfide， NaHS）对脑缺血-再灌注损伤大鼠缺血皮层脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）和酪氨酸激酶B（tyrosine kinase B， TrkB）表达的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1材料 　　NaHS（Sigma公司）。Trizol RNA提取试剂盒、MMLV第一链cDNA合成试剂盒和Hot Star Taq Master Mix试剂盒（Invitrogen公司）。BDNF、TrkB和GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记二抗（Santa cruz公司）。 　　1.2实验动物与分组 　　SPF级雄性SD大鼠，体量200±20 g，南华大学动物部提供。大鼠随机分为5组：假手术、缺血再灌注模型和NaHS处理组（10、50和100 μmol/kg），每组10只。在再灌注前30分钟腹腔注射NaHS。假手术和模型组给等量生理盐水。 　　1.3动物模型制备 　　采用线栓法制备大鼠大脑右侧中动脉局灶性脑缺血-再灌注模型。大鼠麻醉后，固定兔台上，做颈部正中切口，分离右侧颈总、颈内和外动脉，在颈总动脉分叉处结扎颈外动脉，在颈总动脉处剪一小口，插入直径约0.28 mm头端为圆钝形的尼龙鱼线，插入长度18 mm，堵塞大脑中动脉。将颈总动脉和尼龙鱼线一起结扎，缝合皮肤。在阻断血流2 h后，拔出尼龙鱼线恢复血供，再灌注72 h。 　　1.4实时定量PCR检测 　　选取梗死区皮层脑组织，Trizol提取脑组织的总RNA。提取的总RNA为模板进行逆转录反应，合成cDNA第一链。梯度稀释cDNA样品后，进行定量PCR反应。PCR反应体系包括4 μL cDNA，1 μL 5 U/μL的Taq DNA聚合酶，1 μL 50×双链DNA特异性结合的荧光染料，上下游引物各1 μL，8 μL 2×dNTP混合物，其余用蒸馏水补足，反应总体系为30 μL。反应条件为：95 ℃，10秒；62 ℃，30秒；共进行45个循环。采用2-△△CT法处理数据，以假手术组为100%对目的基因的mRNA表达进行分析。 　　1.5 Western blotting检测 　　提取梗死区皮层脑组织总蛋白， 100 μL蛋白样本加入到2×SDS凝胶加样缓冲液中煮沸使蛋白变性。凝胶电泳分离蛋白，分离的蛋白转膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗鼠BDNF、TrkB和GAPDH一抗，4 ℃下过夜。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，孵育6 h。显影后对胶片进行扫描和半定量分析半定量分析。 　　1.6 统计学处理 　　计量数据均以 ±SD表示，SPSS 17.0统计软件分析处理，组间差异比较用单因素方差分析和LSD-t检验进行分析，P﹤0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1外源性H2S对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死侧皮层BDNF和TrkB mRNA和蛋白表达的影响 　　与假手术组比较，脑缺血再灌注损伤模型组大鼠脑梗死侧皮层BDNF和TrkB mRNA和蛋白表达显著增加（均P﹤0.05）。与模型组比较，50 和100 μmol/kg NaHS处理组大鼠脑梗死侧皮层BDNF和TrkB mRNA和蛋白表达均显著增加，呈浓度依赖性（均P﹤0.05）。见图1。 　　3讨论 　　研究表明缺血梗死组织的血液供应恢复后，反而加重对组织的损伤，这种现象称为