线拴法建立小鼠局灶性脑缺血再灌注模型经验总结.docVIP

线拴法建立小鼠局灶性脑缺血再灌注模型经验总结 　　摘要：目的 建立小鼠局灶性脑缺血再灌注模型，并总结经验教训。方法 从颈外动脉插入栓塞线至颈内动脉，选择性栓塞大脑中动脉，造成大脑中动脉闭塞的动物模型。通过控制再灌注时间，观察其对小鼠神经行为学、脑缺血程度及存活期的影响。结果 除假手术组未制成脑缺血模型外，其他3组均于手术后24h出现神经行为学异常，脑切片TTC染色可见缺血病灶。结论 小鼠局灶性脑缺血再灌注模型制造成功，小鼠术后的成活率、梗死体积、神经行为学表现与手术方法密切相关。 　　关键词：小鼠；大脑中动脉闭塞；动物模型；线拴法 　　中图分类号：R743．3l R255．2 　　文献标识码：A 　　文章编号：1672―1349(2007)06―0511―03 　　在临床缺血性脑血管病中，最为常见的是火脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)引起的，因此在动物实验中也较常采用大脑中动脉闭塞的动物模型。由于大鼠的脑血管分布与人类相似，并且易存活、抵抗力强，同时便于进行动物智能测试及电生理检查，因而目前MCAO模型大都以大鼠为主。而小鼠因为其体积小、操作困难，尽管动物成本低廉，仍然使其应用受到限制。但随着医疗设备、实验器材以及技术水平的提高，已经克服了上述困难，加上转基因小鼠的日益应用，使得小鼠局灶性脑缺血／再灌注模型被广泛采用。本实验根据国外制作小鼠MCAO模型的先进经验和国内现有报道，将实验操作方法及所得经验教训简述如下，以便同行交流。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1．1材料的准备　健康6周龄雄性昆明小鼠(购自山东大学西校区动物中心)40只，体重(22～25)g。2，3，5一氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazoliu chloride，TTC，上海国药集团生化公司生产)，MOTIC手术显微镜(SMZ系列)，显微手术剪刀，系结镊子，开睑器(均为六六视觉公司生产)。栓塞用线：使用蓝色6－0号单纤丝尼龙线，剪成长2cm的线段，用酒精灯将两端烧成圆球形以备用。 　　1．2实验方法 　　1．2．1动物分组　40只小鼠随机分为4组，即永久闭塞组、缺血0．5 h再灌注24h组、缺血1h再灌注24h组、假手术组，每组10只。 　　1．2．2模型制作　用10％的水合氯醛(350 mg／kg)将小鼠腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，保持呼吸通畅。用酒精棉球擦拭颈部，在颈正中切口，钝性分离下颌下腺，显微镜下游离左侧颈总动脉，使用微血管夹夹闭。游离左侧颈外动脉，用6―0号丝线结扎其远端，在左颈总动脉分叉至前一颈外动脉结扎线之间打一松结，游离左颈内动脉并用微血管夹夹闭。用显微眼科手术剪刀在两结扎线之间剪一小口，将栓塞线向下插入至颈总动脉处，将松结扎紧，在颈外动脉远端结扎处下方、栓塞线插入的上方剪断左颈外动脉，撤离颈内动脉处的微血管夹，并使栓塞线插入端在左颈总动脉分叉处。将颈外动脉拉向外下方，使其与颈内动脉处于同一直线。将栓塞线向颈内动脉方向插入1cm左右，直至感受到阻力，为防止出血将6―0丝线扎紧。永久闭塞组此时即可将颈总动脉处微血管夹撤离，缝皮；缺血0．5h再灌注24 h组、缺血1 h再灌注24 h组即是在缺血0．5h和1h后将栓塞线和左颈总动脉处微血管夹撤出，保持动脉流畅24h。假手术组不插入栓塞线，剪断左颈外动脉后，左颈总动脉夹闭1h后撤血管夹，缝皮。术后将小鼠置于放有清洁垫料的饲养盒中，室温保持在(25～28)℃自由饮水、进食。 　　1．2．3神经行为学评分　术后24h，采用5 min对小鼠的神经功能缺损进行评分。0分：无神经缺损症状；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右旋转；3分：行走向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1分～4分为有效动物缺血模型。 　　1．2．4脑梗死体积的计算　术后24 h断头取脑，迅速置－20℃冷冻箱中冷冻20 min后取出，在操作台上迅速由前向后行厚2．0mm的冠状切片，将切片立即置于质量分数为1％的TTC磷酸盐缓冲液中，避光37℃恒温孵育30 min。用数码相机按顺序拍摄染色后的脑片，用计算机软件(NIH Image 1．54)计算每一脑片缺血区的面积(SIN)以及双侧大脑面积(SN)，按公式A＝XSIN／XSN×100％计算脑梗死区占整个大脑体积的百分比。 　　1．3统计学处理　采用SPSS统计软件进行数据统计，计量资料采用t检验、配对t检验等方法；计数资料采用r2检验；等级资料采用Ridit分析。 　　 　　2结果 　　 　　2．1神经行为学评分(见表1)观察术后小鼠表现，经统计分析，除假手术组无明显的缺血行为表现外，其他3组均表现出神经行为学异常，为有效动物缺血模型。但经观察，缺血后再灌注的两