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细菌活但非可培养状态研究进展 　　【摘 要】细菌“活的非可培养状态”（viable but non-culturable state ，VBNC）概念的提出对公共卫生学、微生物学、预防医学等传统学科产生了巨大冲击，大量研究结果证明很多细菌包括许多重要病原菌均可进入VBNC状态。处于VBNC状态的细菌在常规培养基上不生长，但在一定条件下可以复苏并保持毒力，实验表明部分病原菌处于VBNC状态仍具有致病性。本文对目前国内外关于VBNC状态细菌的研究进行了如下综述。 　　【关键词】活的非可培养状态；致病性；复苏 　　自上世纪80年代提出细菌“活的非可培养状态”至今，作为公认的非可培养微生物，它一直是流行病学、预防医学以及公共卫生检验检疫等方面的热点研究问题之一。大量研究已证明，许多重要病原菌都存在VBNC状态，由于该特殊存在形式使得其可能逃避传统的检测手段监测，从而造成流行病学及公共卫生学隐患。本文对目前国内外关于VBNC状态细菌的研究进行了如下综述。 　　1.VBNC状态细菌的生物学特性 　　1.1. 形态学变化 处于VBNC状态的细菌形态会发生改变。大多数G-菌会出现体积变小，由杆状或弧状变为球杆状甚至有些会缩成球形。当然并非所有的G-都会缩小，有研究表明G-的Enterococcus f aecalis 的形态变化没有变小反而有轻微的伸长。这也说明其形态的变化可能只是菌体对于环境变化产生的一种自我保护现象。尽管VBNC状态细菌其形态会发生变化，其细胞内核蛋白体和合算物质密度明显降低，但其细胞外膜是保持正常的。 　　1.2. 生理生化特性的改变 处于VBNC状态的细菌其对底物吸收减少，核糖体及染色质核素密度明显降低。细胞中浓缩，蛋白质和脂质总量下降。但细菌在开始进入VBNC状态时一般会合成一些新的蛋白，如费氏霍乱弧菌能合成出40种新的正常条件下没有的蛋白质。此外，VBNC状态细菌的营养盐转运及呼吸速率还明显下降。Tholozan发现，C.jejuni进入VBNC状态后膜内外pH梯度、膜内K+浓度和膜势能均降低，ATP及ADP浓度降低，30d后仅能检测到AMP存在。HEIM等发现粪肠球菌处于VBNC 状态时， ET2Tu 明显降低， EF2Ts 合成增多。ET2Tu 为蛋白质合成的关键酶，在VBNC 状态时降低说明蛋白质合成下降， EF2Ts 的增多是细菌的代谢调节机制造成的，EF2Ts 可促进ET2Tu 再利用，从而保证细菌在低代谢水平上合成少量蛋白质。 　　2.VBNC状态细菌的致病性 　　大量实验实验证明进入VBNC状态的病原菌并不意味着其致病性的消失。Saux等人曾应用半套式RT-PCR对于进入VBNC状态的V.vulnificus进行检测，证实其仍有细胞毒素-溶血素vvhA的mRNA的存在；Colwell等人证实VBNC状态的V.cholerae仍然能够导致人腹泻，并发现进入VBNC状态28d后该菌依然可以产生霍乱毒素，经过PCR检测也证实了该基因的存在；Rahman等人对VBNC状态的S.dysenteriae进行组织培养实验并同时应用PCR和ELISA方法进行检测，发现VBNC状态下的该菌不但仍然保留着志贺菌毒素stx基因和具有生物活性的ShT毒素蛋白，而且该菌对于小肠表皮细胞仍具有吸附能力。 　　当然，并非所以的VBNC状态病原菌都具有毒性。大量事实说明细菌进入VBNC状态时间越久，其细胞完整性越容易受到破坏，从而导致其感染能力下降，而有的甚至失去复苏的能力。然而由于实验室条件的特殊性存在，在实验室中获得的结果在某些情况下可能与实际情况有一定的差距，也就是说某些细菌其在实验室条件下的存活情况以及其致病性状况的改变并不能将其完全视为自然环境中的真实体现。 　　3.VBNC状态细菌的检测 　　目前应用于VBNC细菌的检查方法众多，然而任何方法都有其本身的局限性，因此对于活细胞检测方法的选择，还是应该取决于检测的目的。即要获得最大可能的活细胞数目还是要获得最严谨意义上的活细胞数。目前较常用的检测VBNC状态细菌的主要方法有以下几种。 　　3.1 活菌直接计数法（DVC） 　　DVC是基因底物吸收能力的检测方法，也是目前最为常用的检测方法。Kogure于1979年首次使用该方法。该方法主要是在细菌培养物中添加少量的DNA合成抑制剂萘啶酮酸，培养数小时后用戊二醛或甲醛固定，经吖啶橙染色后用落射荧光显微镜进行观察。若观察结果显示细胞变粗且伸长则说明其为存活状态。该方法常被应用与检测自然环境中的某些特定细菌，并时常结合原位杂交、单克隆抗体等技术，其灵敏度较高可以特异性的检测出目标菌体。姚斐等人曾将DVC和IFAT技术结合用来检测VBNC状态的V.parahaemolyticus，实验结果证实其特异性较强