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葛根素诱导破骨细胞自噬机制研究 　　[摘要] 目的 观察葛根素（Pur）对破骨细胞自噬的影响，探讨其诱导破骨细胞自噬的机制。 方法 采用骨髓干细胞分化的方式培养原代破骨细胞，并按加入Pur量的不同，分成10、50、100 μg/L的Pur组和空白对照组，采用免疫印迹技术（Western-Blot）检测提取的自噬相关蛋白及Akt-mTOR通路相关蛋白的表达。 结果 ①10、50、100 μg/L浓度的Pur组与空白对照组比较，其膜型与胞质型微管相关蛋白1轻链3的比值（LC3Ⅱ/Ⅰ）均升高（P 0.01）；10、100 μg/L浓度的Pur组与对照组比较，p62蛋白消耗均增加（P 0.05）。②10、50、100 μg/L浓度的Pur组与空白对照组比较，酸化核糖体蛋白（p-s6）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）均消耗增多（P 0.05）。 结论 Pur能够促进破骨细胞自噬，Akt-mTOR通路或许是Pur诱导破骨细胞自噬的机制之一。 　　[关键词] 葛根素；破骨细胞；自噬；Akt-mTOR通路 　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）05（c）-0020-04 　　[Abstract] Objective To investigate the signaling pathway of puerarin on osteoclasts through autophagy. Methods Osteoclasts were derived from bone marrow stem cells and divided into four groups based on the treated with different concentration of puerarin （0， 10， 50， 100 μg/L groups）. Expression of LC3Ⅱ/Ⅰ， p62， Akt， p-Akt and p-s6 were analyzed by Western-Blot. Results ①Increased LC3Ⅱ/Ⅰ level （10， 50， 100 μg/L groups） and decreased p62 expression （10， 100 μg/L groups） were observed in puerarin-treated groups compared with normal group （P 0.01 or P 0.05）. ②Puerarin inhibited the expression of p-Akt， Akt and p-s6 （P 0.05）. Conclusion Puerarin can promote the autophagy of osteoclasts and may regulate via Akt-mTOR signaling pathway. 　　[Key words] Puerarin； Osteoclasts； Autophagy； Akt-mTOR signal transduction pathway 　　葛根在最早的药学著作《神农本草经》中便有记载，因其能治疗“诸痹”等作用而成为治疗骨质疏松症的一味常用而有效的中药，它可增加骨密度和骨量，改善骨构造而达到治疗作用[1-2]。近年来研究显示，中药葛根在防治骨质疏松症的体内外实验方面都取得了良好的效果，而葛根素（puerarin，Pur）在葛根的提取物异黄酮类化合物中含量最高，是其特有的主要有效成分，因此Pur的作用机制研究成了研究葛根的热点领域[3]。Pur能够促进成骨细胞形成与分化[4]，增加血清碱性磷酸酶（ALP）的表达[5]，而且有文献提出，Pur还能对破骨细胞的活性产生一定的抑制作用[6]。在分子水平上，有文献指出，Pur能通过促进自噬作用来保护1-甲基-4-苯基-吡啶离子（MPP+）诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤[7]。另外有研究提出，破骨细胞自噬水平的提高会对其活性及分化过程起负向调控作用[8]，但其具体机制尚未明确。本研究通过观察不同浓度Pur组和不加入Pur的对照组对破骨细胞自噬的影响，探究其自噬的相关信号通路，旨在从分子水平上探讨Pur对破骨细胞自噬的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 　　2月龄不分雌雄的昆明（KM）小鼠，无特定病原体（SPF）级，由广东省中医院实验动物中心提供。 　　1.2 主要试剂及仪器 　　葛根素（阿拉丁公司，批号：CAS3681-99-0）；α-MEM培养基、胎牛血清和青链霉素（美国，Hyclone公司）；BCA蛋白质定量测定试剂盒（