北柴胡3个ugt基因表达特性及其原核表达与蛋白纯化-生药学专业论文.docxVIP

学 术 诚 信 承 诺 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得佳木斯大 学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 签名： 日期： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解佳木斯大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文 的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 （保密的论文在解密后应遵循此规定） 签名： 导师签名： 日期： 目 录 一、中文摘要 1 二、英文摘要 3 三、前言 5 四、文献综述 6 五、材料与方法 13 六、结果 37 七、讨论 63 八、结论 65 九、参考文献 67 十、致谢 71 十一、英文缩写 72 十二、攻读学位期间发表的论文 74 十三、附图 75 佳木斯大学硕士学位论文 - - PAGE 10 - 一 中文摘要 目的：分析北柴胡 3 个 UGT 基因的 MeJA 诱导表达特性和组织表达，原核表达并 纯化出 UGT 蛋白，为进行体外催化反应分析 UGT 基因功能奠定基础。 方法：提取 MeJA 处理不定根和未处理对照不定根的 RNA 以及北柴胡根、茎、 叶、花和果实中的 RNA，以柴胡皂苷合成途径关键酶 β-AS 基因为参照，qRT-PCR 分析 BcUGT1、BcUGT3 和 BcUGT6 的 MeJA 诱导表达和组织表达变化。设计含有酶切位点 的 PCR 引物，PCR 扩增 BcUGT1、BcUGT3 和 BcUGT6 的 ORF，酶切后，分别插入到 pET-28a（+）、pET-30a（+）载体中，以构建出原核表达载体。利用大肠杆菌 BL21 （DE3）plysS、BL21-CodonPlus（DE3）和 Rosetta-gamiB（DE3）plysS 三种不同菌株 不同温度及 IPTG 浓度表达外源蛋白 UGT。采用 PrepEase His 标签蛋白纯化试剂盒纯化 重组蛋白，Western blot 证实蛋白诱导纯化。 结果：利用 qRT-PCR 分析 BcUGT1、BcUGT3 和 BcUGT6 与柴胡皂苷合成途径关 键酶基因 β-AS 的共诱导表达和组织表达，以 β-AS 的模式为参照，β-AS 主要在根中表 达。 共诱导表达结果显示，MeJA处理后，柴胡皂苷a含量增加与BcUGT1基因表达量增 加相对应。BcUGT3和BcUGT6表达水平均有所提高，BcUGT3的表达随时间延长不断增 加，4 d时，达7倍左右，BcUGT6表达水平均提高2倍左右。 组织表达结果显示，BcUGT1在根中的表达相对较高，其次是在果实和茎中的表 达，在叶和花中的表达量较低。BcUGT3在根、叶、花和果中的表达水平相当，均高于 茎中的表达水平。BcUGT6在叶中表达水平最高，在花中表达水平最低。 原核表达结果显示，BcUGT1以pET-28a（+）和pET-30a（+）为载体，BcUGT3以 pET-28a（+）为载体，均以BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL为宿主菌，0.5 mM或1 mM IPTG，16 °C，20 h为条件，诱导出了目的蛋白。BcUGT6以pET-28a（+）为载体， Rosetta-gami B（DE3）plysS为宿主菌，0.5 mM IPTG，20 °C，24 h为条件，诱导出了 目的蛋白。均利用PrepEase His标签蛋白纯化试剂盒，纯化获得了目的蛋白。 结论：BcUGT1、BcUGT3和BcUGT6基因的表达特性分析表明这三个基因可能参与 柴胡皂苷生物合成，三个基因的体外表达成功，为进一步通过酶活分析证实其功能奠定 了基础。 关键字：北柴胡；UGT 基因；组织表达；原核表达；蛋白纯化 二 Abstract Objective: Using qRT-PCR method, the expression characterizations of BcUGT1、 BcUGT3 and BcUGT6 of Bupleurum chinense DC. after methyl jasmonate (MeJA) induction and in different plant tissues were investigated. The target protein was successfully expressed and purified. The present work will be helpful