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菌种比浊度与菌含量关系及其应用 　　摘 要：简介比浊法和活菌计数法测定菌液浓度的操作步骤和优缺点，将比浊法与活菌计数法相结合，测定了常见模式菌株比浊度对应的活菌计数浓度，为菌种浓度的预估提供一个快速，准确，便捷的方法。 　　关键词：菌液浓度；活菌计数；比浊度 　　在微生物检验工作中，比如药品微生物限度检查方法验证、防腐效力测试、消毒液消毒效果验证、培养基适用性检查等等，常常需要加入一定浓度的菌悬液，菌液浓度过高或过低都将影响测试结果的准确性，因此控制菌液浓度是必要且关键的一步。测定菌液浓度的方法一般有三种，其一为活菌计数法，此法能准确判断菌液浓度，是目前国内的仲裁法，但是该法需要培养后计数，有明显的滞后性；其二为显微镜观察法，该方法适用于菌体较大的菌种浓度的测定，如霉菌和酵母菌，具有方便快捷的优点，但不适用于菌体细小的菌种浓度的测定，有较大的局限性；三为比浊法，此法能快速地判断菌液浓度，但结果为粗略的估计值，不同大小的菌种其形成的光密度不同，因此同一个比浊度，不同的菌结果差异较大，准确性不高。 　　本文具体介绍将比浊法和活菌计数法相结合的测定方法，测定了常见模式菌株1麦氏比浊度（MCFARLAND）的菌液浓度，用于指导日常微生物检测工作中菌液浓度的快速、准确测定，具有较强的实用价值。 　　一、菌种及菌液的制备 　　1.菌种 　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538） 　　铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027） 　　大肠埃希菌（Escherichia coli ATCC 8739） 　　枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilisATCC 6633） 　　乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphiCMCC（B）50094） 　　白色念珠菌（Candida albicans ATCC 10231） 　　黑曲霉（Aspergillusniger ATCC 16404） 　　以上菌种从广东省微生物菌种保藏中心采购，经复苏两代至五代内使用。 　　2.菌液的制备 　　（1）将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌的冻干管封口端（即远离冻干粉的一端）在火焰上分别灼烧后，迅速滴加几滴灭菌水，使灼烧处管口裂口后，在生物安全柜内用灭菌镊子轻轻掰开裂口，分别用0.5mL TSB溶解冻干菌种，然后将溶解后的冻干菌株全部转移到10mL TSB中，置36±1℃恒温培养箱中培养18～24小时，此为第一代菌种。在生物安全柜内分别用无菌接种环挑取1接种环第一代上述菌悬液分别划线接种于TSA中然后置于36±1℃恒温培养箱中培养18～24小时，此为第二代菌种，备用。 　　（2）将白色念珠菌冻干管封口端在火焰上灼烧后，迅速滴加几滴灭菌水，使灼烧处管口裂口后，在生物安全柜内用灭菌镊子轻轻掰开裂口，用0.5mL改良马丁液体培养基溶解冻干菌种，然后将溶解后的冻干菌株全部转移到10mL 改良马丁液体培养基中，置28±1℃恒温培养箱中培养24～48小时，此为第一代菌种。在生物安全柜内无菌接种环挑取1接种环第一代菌悬液划线接种于改良马丁琼脂培养基中。将新鲜接种的改良马丁琼脂培养基置28±1℃恒温培养箱中培养24～48小时，此为第二代菌种，备用。 　　（3）将黑曲霉冻干管封口端在火焰上灼烧后，迅速滴加几滴灭菌水，使灼烧处管口裂口后，在生物安全柜内用灭菌镊子轻轻掰开裂口，用0.5mL含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液溶解冻干菌种，然后将溶解后的冻干菌株划线接种到改良马丁琼脂斜面培养基中，置28±1℃恒温培养箱中培养5～7天，此为第一代菌种。在生物安全柜内，用无菌接种环挑取1接种环第一代黑曲霉划线接种于改良马丁琼脂斜面培养基中。然后置28±1℃恒温培养箱中培养5～7天，此为第二代菌种。向第二代黑曲霉菌种管内加入5ml含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌接种环将孢子洗脱，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，备用。 　　二、培养基和仪器 　　1.培养基 　　（1）商品培养基。 　　胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）瓶装颗粒培养基 　　胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA） 　　改良马丁液体培养基 　　改良马丁琼脂培养基 　　0.5%无菌T.T.C 　　以上培养基从广东环凯微生物科技有限公司采购商品培养基，按产品说明书配制，灭菌后备用，其中TSA在使用前每100mL培养基加入1mL0.5%无菌T.T.C以便于细菌菌落的观察。 　　（2）按配方配制的培养基。 　　0.85%氯化钠 　　0.9%氯化钠 　　含0.05%吐温80的0.