生物工程下游技术第十二、第十三节+液相色谱用填充材.ppt

摩洛哥北撒哈拉 夏威夷考艾岛路玛哈伊海滩 第十二章 液相色谱用填充材料-羟基磷灰石 羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP) -----一种胶体磷酸钙，广泛存在于人体和牛乳中，人体内主要分布于骨骼和牙齿中，牛乳内主要分布于酪蛋白胶粒和乳清中。 实质上是一种高度交错聚合的高分子磷酸钙聚合物，其分子式为 Ca10(PO4)6(OH)2，其中钙磷元素摩尔比值为1.67。在骨骼和牙齿中，钙和磷又主要以胶体磷酸钙结晶形态存在，并和胶原蛋白质共同构成复杂的网络结构。 其材料本是骨骼和牙齿等生物硬组织的主要无机成分,与生物组织有特异性的亲和力和相容性。 实验研究表明，HAP纳米粒子对肝癌、胃癌、骨肉瘤等多种癌细胞的生长具有不同程度的抑制作用。 1000元/公斤 胶体磷酸钙应用范围较广，涵盖乳品、饮料、糖果、烘焙食品及钙片等各种需要进行钙强化的食品。 在天然食品中，以鲜奶等乳制品的含钙量最高，如果完全从这些食品中获取钙质，最大的问题就是必须摄入大量食物才能得到所需的钙质，同时会摄入大量的热量和脂肪，因此，摄取高钙食品是补充钙质的最好方式。 胶体磷酸钙的钙含量为24% ，鲜奶一般的钙含量为 100mg/100ml ，再额外添加 0.1g /100ml 的胶体磷酸钙，奶制品的成品钙含量即可达到 120mg/100ml ，达到高钙牛奶的要求。 一、基本概念 羟基磷灰石是一种弱阳离子或弱阴离子交换层析材料。 优点:能精确地分离、纯化结构上只有微小差别的生物大分子。 二、HAP的性能 高机械强度:可以耐受15MPa以上压力,陶瓷HAP可以耐受几十MPa的压力。 高柱效:球形HAP颗粒大小、形状及孔隙大小均适合HPLC的要求，其颗粒及孔径小，有比较高的柱效。 化学和热稳定性:是磷酸钙盐中最稳定的,在中性和碱性水相中非常稳定,溶解度很低,热稳定性很高,可采用高温制备方法生产。 低的非可逆性吸附:HAP有非常低的非可逆性吸附。 表面修饰性:HAP表面比较容易进行各种化学修饰。 三、HAP制备方法 （一）通常有干法、水热法和湿法。 在正常条件下，填料粒度＞20μm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20μm时，湿法填充较为理想。 用于色谱的HAP制备以湿法为主。 片状Tiselius型HAP的制备: 因人而得名，即以钙盐或氢氧化钙与碱金属磷酸盐,磷酸铵或磷酸在水溶液中控制反应条件结晶而成不规则的片状晶体。 Ca化合物 P化合物 转型 反应 羟基磷灰石 问题：晶体不规则—→易碎—→颗粒大小波动—→色谱柱的填充状态改变—→柱效降低—→重复性变差。 如何解决？ 日本人的专利---制造均匀HAP颗粒 以CaHPO4.2H2O晶体颗粒为先导物质，在高于其脱水温度和相变温度，而不致于发生分解的条件下加热，首先脱水相变为CaHPO4，然后用碱处理再转变成晶体HAP，它大小较均匀，约1-3um厚，数微米大小。 2.粒状HAP的制备: 二次造粒:首先制备HAP微晶（微小针棒状）,然后采用喷雾法进行造粒(在适当黏结剂存在下,喷雾干燥HAP微粒悬浮物成为球粒)。 克服易碎----微晶聚集成球形颗粒 Ca化合物 P化合物 造粒 二次粒子：1~100um；孔径：80~90nm 反应 一次粒子0~1um 羟基磷灰石 喷雾热解技术:硝酸钙和磷酸的甲醇溶液在800～1400oC之内高温喷雾热解制备球形颗粒。 图4 不同温度煅烧HA粉末的TEM照片, (a) 750℃, (b) 900℃ (a) (b) （二）制备球形羟基磷灰石的新方法 1.复合球形羟基磷灰石 2.直接合成球形羟基磷灰石 复合成球 HAP的色谱机理 是一种弱离子交换色谱,实验结果表明其对DNA、多肽、蛋白质的分离机理合乎离子交换色谱的机理。 HAP的色谱机理可能包括以下几个方面: 存在两种不同的吸附晶面; 两种不同晶面吸附方式不同; 两种不同吸附点的起因:Ca2+离子和PO43-; 色谱历程为离子间的竞争过程。 HAP在生化产物分离中的应用 一般应用领域:糖类,多肽,蛋白质,酶,核糖核酸。 单克隆抗体的分离纯化。 结构差异很小的蛋白质分离。 问题 HAP是什么原理的色谱?为什么HAP具有比较高的分辩力? HAP色谱填料的主要特点? 第十三章 径向色谱柱的发展与应用 传统色谱存在的问题 放大过程的困难； 保证生物物质活性的困难：生物样品的分离纯化过程对环境的要求较严，生物组成成分复杂，分子量较大，比较敏感，增加其使用的难度； 生产效率的问题。 什么是径向色谱 采用径向流技术的色谱,即样品和流动相沿径向流动,可以从色谱柱的周围流向圆心,也可以从圆心流向柱的周围,通常采用从柱的周围流向圆心的方式。 径向色谱技术的发展可以追溯到五十年以前, 1947年发明的借助离心力分离溶液的装置,