变性高效液相色谱技术在快速检测食品微生物中的应用研究-农产品贮藏与加工专业论文.docxVIP

摘 要 本研究以产黄曲霉毒素菌，白色念珠菌，A 型肉毒梭菌，凝结芽孢杆菌及发酵乳 杆菌为研究对象，基于分子生物学技术，采用变性高效液相色谱法结合常规的 PCR， 初步建立了快速高效的检测方法，以期为食品致病微生物的快速检测方法建立提供理 论基础和科学依据。通过研究，主要结果如下： 1、应用 PCR 反应结合变性高效液相色谱技术，建立食品中产黄曲霉毒素菌的快 速检测方法。以编码黄曲霉毒素生物合成的转录激活子 aflR 基因为靶基因设计引物， 建立并优化了快速鉴别产黄曲霉毒素菌的 PCR 体系，扩增产物为 184 bp，特异性和 灵敏度都比较高，最低检测限可达到 100 cfu/ml；在随机采集的 75 份不同类样品中检 出 2 份阳性样品，与普通 PCR 和传统方法结果一致。 2、应用PCR反应结合变性高效液相色谱技术，建立食品中白色念珠菌的快速检 测方法。以白色念珠菌特有的靶序列酸性蛋白酶基因SAP6设计特异性引物：F为5`- CTGGGTCTTCTGATTTGTGG -3`，R为5`- CTGGTAGCTTCGTTGGTTTG -3`，扩增片断长度 为307 bp，建立并优化PCR体系，结果表明其特异性良好，灵敏度检测极限为1.0×103 cfu/ml，可以快速准确的检测出乳粉中的白色念珠菌。 3、应用 PCR 反应结合变性高效液相色谱技术，建立食品中 A 型肉毒梭菌的快速 检测方法。根据 A 型肉毒梭菌的 A 型肉毒神经毒素基因作为靶基因设计特异性引物， 以非 A 型肉毒梭菌、产气荚膜梭菌等 23 株参考菌株做特异性检测，并将 DNA 模板 稀释成不同梯度做灵敏度检测，结果表明引物的特异性良好，检测灵敏度高，检测低 限可达到为 110 ng/tube。 4、以编码凝结芽孢杆菌的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因与发酵乳酸延伸因子（EF-Tu） 基 因 作 为 靶 基 因 分 别 设 计 引 物 ：（ 1 ） 凝 结 芽 孢 杆 菌 引 物 序 列 ： F 为 5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA-3’， R 为 5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’，扩增片断长 度为 555bp；（2）发酵乳杆菌引物序列： F 为 5’-TGATGGTCCTATGCCACAAA-3’， R 为 5’- TCAACACCGGTAACAGTGGA-3’，扩增片断长度为 456bp。建立并优化 PCR 体系， 结果表明其特异性良好，凝结芽孢杆菌的灵敏度检测极限为 1.0×102cfu/mL，发酵乳 杆菌为 7.6×102cfu/mL。 关键词：变性高效液相色谱；食品微生物；检测方法； 研究 Ⅰ Ⅱ Ⅱ Abstract In this paper, based on the molecular biology technology, The flatoxigenic bacteria of Aspergillus, candida albicans, Clostridium botulinum-A ， Bacillus coagulans, Lactobacillus fermenti were selected to establish a rapid detection method by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) and polymerase chain reaction (PCR). Our aim is to offer theoretical basis and scientific support for quick testing microorganisms in food. The main results are as follows after investigation: The technologies of PCR and DHPLC were applied to provide a method for detection flatoxigenic bacteria in food rapidly. AflR gene from a coded aflatoxin biosynthesis was taken as the target design primer. The PCR system causing aflatoxin could rapidly be recognized by the method established and optimized. The amplification segment was 184 b