脑缺血再灌注与梗死灶重塑的实验研究.ppt

脑缺血再灌注与梗死灶重塑的实验研究 河北北方学院附属第一医院神经内科 邹玉安 教授 研究背景 血管结构 电生理结构 支持结构（神经胶质细胞） 我们把胶质细胞作为研究的主要方向。 在缺血性脑血管病(ICVD)的研究领域，脑缺血再灌注是目前研究的比较多的一个方面。 脑梗死灶的分布规律从结构和功能上分为三个带，不同区域发生神经细胞死亡的程度和机制不尽相同。①缺血中心区(坏死区)；②缺血半暗带区：梗死灶中心周围的缺血性脑组织；③正常脑组织区。 细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤的病理生理机制中有着重要的地位。由于凋亡的过程不发生溶酶体、细胞膜的破裂，因此不引起炎症级联反应和机体组织的次级损伤。 胶质细胞过度增生导致瘢痕形成和神经元的轴突再生障碍。缺血半暗带、梗死灶中心，这两个部位的细胞凋亡及胶质细胞的表达与病灶重塑关系极为密切。 本实验研究通过对大鼠脑缺血再灌注模型的复制，以梗死灶中心、缺血半暗带的凋亡神经细胞及胶质细胞为切入点，研究中药组干预治疗后，再灌注不同时间对Bcl-2、Bax mRNA及蛋白水平的表达，NGF、GFAP蛋白水平表达，细胞凋亡DNA水平检测及流式细胞仪检测S期细胞百分率的观察，探讨中药组对病灶重塑的影响。 材料与方法 实验动物和分组 健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠280只，重量（280±10）g，随机将大鼠分成7组（n=40） 正常组（Normal） 假手术组（Sham-operated） 模型组（Model） 盐酸法舒地尔注射液组（Fasudil） 中药大剂量组 中药中剂量组 中药小剂量组 模型复制 采用改进Longa线栓法复制大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型（MCAO）。TTC染色计算脑梗死体积。 药物成分 中药组：由黄芪60g、三七10g、葛根10g、天麻10g、川芎10g、地龙15g、栀子18g、钩藤10g等组成。常规煎煮、浓缩，置4℃冰箱保存备用。 盐酸法舒地尔注射液(川威)：天津红日药业股份有限公司生产（国药准字产品批号：060804；规格2ml:30mg）。 给药方法 预给药七天，造模后继续给药至各时间点。中药组采用灌胃法，盐酸法舒地尔注射液组采用腹腔注射；给药剂量按大鼠与人体表面积等效剂量折算，中药组分为三个剂量组： 盐酸法舒地尔组：6.3mg·kg-1 中药大剂量组： 30.0300g·kg-1 中药中剂量组： 15.0150g·kg-1 中药小剂量组： 7.5075g·kg-1 假手术组和模型组动物给予等量自来水灌胃，方法同上。 SD大鼠神经系统症状体征的观察与评分标准 动物清醒后，观察大鼠的神经系统症状，缺血再灌注后12h，24h，48h，72h各检测一次神经病学症状，共4次。根据Longa建立的神经功能缺损程度的五级四分法标准系统地评分。 主要试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒(POD) 武汉博士德生物工程有限公司 原位杂交检测试剂盒（Bcl-2、Bax） 武汉博士德生物工程有限公司 免疫组化检测试剂盒（Bcl-2、Bax、NGF、GFAP） 北京中杉金桥生物技术有限公司 DAB显色试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 主要仪器 光学显微镜 日本OLYMPUS BX60型 显微摄影装置 日本NIKON F15型 图像采集分析系统 Nikon ECLIPSE公司 医用低温冰箱 日本SANYO公司 生物组织摊烤片机 浙江省金华科迪公司KD-T型 自动脱水机 美国ThermoScientific Shandon系列 石蜡切片机 美国Thermo Shandon Finesse? 325 流式细胞仪 Becton-Dickinson公司(FACS Calibur) 统计学处理方法 所有数据以均数±标准差（ ）的形式表示，应用SPSS16.0软件统计。对资料方差齐性进行Levene检验，按α=0.10水准。若方差齐，多样本均数间比较，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。多重比较采用Student-Newman-Keuls( S-N-K)检验。方差不齐资料采用秩和检验。P≤0.05认为差异具有显著性。 2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride,TTC） 再灌注24 h后，每组随机抽取6只大鼠进行TTC染色； 取冠状面连续等距离切取5个脑片，每片约厚2-3mm； 2%TTC孵育