非靶向代谢组学用于藜芦妨害人参治疗脾气虚机制研究.docVIP

非靶向代谢组学用于藜芦妨害人参治疗脾气虚机制研究 　　摘要 采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC/QTOFMS）联用技术，通过非靶向代谢组学方法分析大鼠尿液内源性代谢物的变化，研究藜芦妨害人参发挥药效作用的机制。建立脾气虚大鼠模型，连续给药15天，测定力竭游泳时间及血液中白细胞、红细胞、血红蛋白的含量。结果表明，人参可显著提高脾气虚模型大鼠的力竭游泳时间（p0.05），人参与藜芦配伍后对脾气虚模型大鼠各项指标均无显著影响（p0.05），表明藜芦妨害了人参发挥药效作用。采用UPLC/QTOFMS技术及非靶向代谢组学的方法分析了空白组、模型组、人参组、藜芦组、参藜组对脾气虚模型大鼠的尿液代谢组差异，其中主成分分析（PCA）得分图显示各组代谢轮廓有显著差别，并通过正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）及数据库检索，鉴定出15种人参干预调节脾气虚模型大鼠的潜在生物标志物，从中找出了7种人参藜芦配伍后减弱人参上述干预作用的潜在生物标志物，并对其涉及的代谢通路进行了系统分析。上述研究结果表明，人参藜芦配伍后妨害了人参对脾气虚模型大鼠的治疗作用，其机理可能是影响人参对体内能量代谢、免疫平衡及氧化还原反应等相关代谢的调节。 　　?P键词人参；藜芦；配伍禁忌；脾气虚；非靶向代谢组学 　　1引言 　　“相反”是中药七情配伍理论的重要组成部分，属于配伍禁忌，历代各家本草均指出“十八反”决不可用。金元时期的医家张子和总结了前人各家之说创作了十八反的歌诀，其中人参作为“百草之王”应用于数万方剂中，与藜芦的相反作用也成为最有代表性配伍禁忌之一。 　　目前，关于“十八反”的作用机制的争论主要集中在配伍后会增加毒性或降低药效两个方面[1～3＼]。但是在临床应用、合用后化学成分变化、药效毒理以及药物吸收代谢等方面的研究表明，“十八反”都没有明显一致的规律[4＼]。因此有效地结合新的研究技术及方法对配伍的每一个环节，如体内吸收、分布、代谢、排泄和生理病理变化等情况进行考察，挖掘其中的内在联系，有助于揭示“十八反”的科学内涵[5，6＼]。 　　代谢组学作为系统生物学的分支，是研究代谢组在新陈代谢某一动态时刻的变化规律的一门学科[7＼]。它将人体作为一个完整的动态系统，因此被越来越多地应用于中医中药的相关研究中[8，9＼]。目前，最常用的分析方法是核磁共振（NMR）和各种质谱联用，如液质联用（LCMS，UPLCMS，UPLCMS/MS），JP气质联用（GCMS，GCQTOFMS/MS），电泳质谱联用（CEMS）和等离子体质谱（ICPMS）等[9，10＼]。 　　代谢组学按其研究的目的可分为靶向和非靶向代谢组学。其中靶向代谢组学是研究少数几种或几类结构、性质相似或生化功能相关的内源性代谢物。非靶向代谢组学则是针对生物样品中尽可能多的内源性代谢物进行研究[11＼]。 　　本研究拟通过采用非靶向代谢组学的研究方法，结合UPLCMS联用技术，在病理生理条件下考察“十八反”中人参与藜芦这一具有代表性的反药配伍组合干扰、改变、降低或消除药效的作用机制，为更好地诠释中医药配伍禁忌传统理论提供科学依据。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　WatersAcquityUPLC液相色谱系统、QTOFSYNAPTG2HDMS质谱仪（美国Waters公司）；MilliQ超纯水仪（美国Millipore公司）；BC5300Vet全自动血液细胞分析仪（中国深圳迈瑞公司生物医疗电子股份有限公司）；乙腈、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；红细胞、白细胞、血红蛋白生化测定试剂盒（中国长春汇力生物技术有限公司）。 　　人参（PanaxginsengC.A.Mey.）购自吉林抚松县万良人参市场，藜芦（VeratrumnigrumL.）购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，分别取人参、藜芦及人参藜芦（以人参：藜芦10KG-3∶KG-51比例合用）药材适量，加10倍体积水浸泡1h，加热回流提取两次，每次1.5h，合并提取液，浓缩后冻干，保存备用。 　　Wistar大鼠（中国吉林大学白求恩医学院动物实验中心），实验动物许可证：SCXK（吉 　　2.2动物实验 　　雄性Wistar大鼠随机分成5组，分别为空白组、模型组、人参组、藜芦组、参藜组。空白组及模型组给予相同体积蒸馏水，其余各组分别灌胃给予相应药物，每日1次，连续15d。 　　除空白组外，其余各组在给药同时开始造模[13＼]。造模第1天灌胃50°白酒10mL/kg，第2天以后每天灌胃食醋10mL/kg，同时喂饲体质量5%的硝黄饲料（正常饲料、大黄粉、芒硝，以60KG-3∶KG-51KG-3∶KG-51的比例（质量比）混合均匀，即成），每日下午大鼠背部固定质量约为体质量10%的铁丝