食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法研究进展.doc

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法研究进展 　　摘要单核细胞增生李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌,广泛分布于自然界。针对目前单核细胞增生李斯特氏菌的检测现状,总结了4种现行有效的常用检测方法,并对各种检测方法的优缺点进行了分析比较。实时荧光定量PCR检测技术,可精确定量、反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,不需要凝胶电泳过程,避免了扩增产物对环境造成的污染问题,将是未来分析检测发展的一个主要趋势。 　　关键词单核细胞增生李斯特氏菌;传统检测方法;酶联免疫技术;分子生物学技术 　　中图分类号R155.5文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)19-0327-02 　　 　　单核细胞增生李斯特氏菌(Listeie monocytogenes 简称L.M;单增李氏菌)是一种人畜共患病病原菌[1],使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。近年来国外报道该菌所致的食物中毒越来越多,病死率高达30%~70%[2-3]。国内也不断有散发病例,引起了国内医学界的普遍关注。WHO在20世纪90年代已将其列为食品四大致病菌之一[4-5]。该菌在自然界分布广泛,以家畜、家禽兽为主要宿主,很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发[6-7]。食品是导致人类受单核细胞增生李斯特氏菌感染的主要传播途径,该菌在4 ℃冰箱保存的食物中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌。在绝大多数食品中都能找到李斯特氏菌,肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源[8]。随着我国冷藏、速冻食品消费量的迅速增多,食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越突出,因此在食品卫生微生物检验中,必须加以重视。现针对其常用检测方法的优缺点进行分析比较。 　　1传统检测方法――分离培养 　　我国于1994年开始发布单核细胞增生李斯特氏菌检测的国家标准,即GB/T4789.30-1994。目前,很多检测部门和单位在进行食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测时,其主要依据依然是国标法。国标GB/T4789.30-1994自从颁布以来,分别进行了3次修订,分别是GB/T4789.30-2003,GB/T4789.30-2008,直至现在正在实行中的GB/T4789.30-2010版本。修订后的GB/T4789.30-2010法,对于样品检测依次进行增菌、选择性分离平板分离培养、初筛试验、鉴定等步骤,通过增加API鉴定试验代替生化试验和协同溶血试验。虽然近年来显色培养基的应用和ATB生化鉴定仪的联合使用已大大简化了鉴定步骤,缩短了检测周期,但由于ATB生化鉴定仪鉴定单核细胞增生李斯特氏菌主要依据10种生化反应(主要为糖发酵),结果的判定主要是依据颜色变化,因此颜色变化不明显或者不好界定时,其阴阳性判定带有一定的主观性。而且使用的API试条和试剂质量必须是符合有关的要求。另外,由于需要二次增菌、平板分离及生化鉴定,整个过程至少需要4~5 d。总之,传统单核细胞增生李斯特氏菌分离鉴定方法耗时长、程序繁琐、试剂和人力成本都比较高。 　　2免疫学检测技术 　　由于细菌菌体和鞭毛抗原的存在,使得人们可以建立基于抗原-抗体反应的方法来检测食品中的致病菌。目前,从食品中检测单核细胞增生李斯特氏菌的免疫学方法主要是ELISA技术,国标GB/T4789.30-2008中也曾将这一方法列为可供选择的检测方法之一。其检测原理主要是将抗原或抗体结合到固相载体表面,再将抗原或抗体特定基团与酶交联成酶结合物,当酶结合物同相应的抗原或抗体结合后,则形成酶-抗原抗体复合物;当酶遇到相应的底物时,可以催化产物水解、氧化或还原,从而产生有色物质。检测时根据有色物质的有无及其深浅,即可间接推断被检样品中有无相应抗原或抗体存在和数量多少,从而达到定性和定量检测的目的。Farber等[9]于1987年首先报道了针对单核细胞增生李斯特氏菌鞭毛抗原的单克隆抗体ELISA检验程序,应用这一程序,可以在2~3 d内从自然污染的样品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。在国内方面,范红结等[10]在1998年研究获得了3株针对单核细胞增多性李斯特氏菌、无害李斯特氏菌和格氏李斯特氏菌菌体表面蛋白的单克隆抗体,与其他李斯特氏菌和属外菌株不发生反应,为建立LM免疫学检测技术奠定了基础。单核增多李斯特氏菌的免疫学方法主要是ELISA技术,具有操作简便、通量高的特点,可在同一时间内检测大量样品,并可将纯肉汤培养物中的分离物进行属水平的鉴定。但由于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在,还难以进行李斯特氏菌种间特异分析。同时,由于单核细胞增生李斯特氏菌表面抗原极其丰富,且大部分优势表位与属内外细菌有广泛的交叉抗原,给筛选特异性单克隆抗体带来一定的困难,增加了假阳性结果的几率。因