食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法建立.doc

食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法建立 　　摘要建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR 快速检测方法。选取hlyA 基因作为靶序列设计1对引物,在单核细胞增生李斯特氏菌中能扩增出356 bp 的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为46个细菌。用该方法对36 份食品样品进行检测,检测结果与分离鉴定方法完全相符,表明该方法可适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。 　　关键词食品;单核细胞增生李斯特氏菌;PCR快速检测方法 　　中图分类号 TS207.5 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)22-0352-02 　　 　　单核细胞增生李斯特氏菌(Listeie monocytogenes,简称L.M,单增李氏菌),是一种人畜共患病病原菌[1],使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。该菌可通过眼睛及破损的皮肤、粘膜进入体内而造成感染,孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也会引起感染。单增李斯特氏菌不易被冻融,能耐受较高的渗透压,在土壤、地表水、污水、植物、青贮饲养中均有该菌存在,所以动物很容易食入该菌,并通过口腔―粪便的途径进行传播。据报道,健康人粪便中单增李斯特氏菌的携带率0.6%~16.0%,有70%的人可短期带菌,4.0%~8.0%的水产品、5.0%~10.0%的奶及其产品、30.0%以上的肉制品及15.0%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酷、未充分加热的鸡肉、鲜牛奶、冻猪舌等而感染,约占85%~90%的病例是由被污染的食品引起的。近年来,国外报道该菌所致的食物中毒越来越多,病死率高达30%～70%[2-3]。国内也不断有散发病例,引起了国内医学界的普遍关注。WHO在20世纪90年代已将其列为食品四大致病菌之一[4-5]。该菌在自然界分布广泛,以家畜、家禽兽为主要宿主,易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发[6-7]。 　　食品是导致人类受单核细胞增生李斯特氏菌感染的主要传播途径,由于该菌在4 ℃冰箱保存的食物中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。在绝大多数食品中都能找到李斯特氏菌,肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源[8]。随着我国冷藏、速冻食品消费量的迅速增多,食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越突出,因此,在食品卫生微生物检验中必须加以重视。单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活,热处理已杀灭了竞争性菌群,使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活,则在食品加工中,中心温度必须达到70 ℃持续2 min以上。单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在,即使产品已经过热加工处理充分杀灭了李斯特氏菌,但有可能造成产品的二次污染。因此,蒸煮后防治二次污染是极为重要的。目前,国内流行的对单增李氏菌的检测方法为传统培养法,主要是按照国家标准GB4789.30-2010,该方法检测周期冗长,准备工作繁琐,耗时耗力。因此,该试验针对这一状况,拟在建立食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法,并将这一检测方法应用于食品样品的检测,检测结果与传统方法完全相符。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1菌种。单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌种均购自山东省疾病预防控制中心,接种到营养肉汤中制成标准菌液,36 ℃增菌培养。 　　1.1.2检测样品。从济南市各超市及农贸市场购齐36份食品样品,分别为生猪肉、生鸡肉、袋装新鲜牛奶、烤肠、酱肉等几类。将这些样品分别用新建PCR方法和传统培养法进行检测,并对检测结果进行比较。 　　1.1.3核酸DNA制备。细菌基因组的提取使用的是天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒,操作步骤按照提取试剂盒说明进行。 　　1.2主要试剂及溶液的配置 　　PCR 反应试剂盒为大连宝生物工程有限公司生产的TaKaRa产品,细菌培养用显色培养基为法国科玛嘉(郑州博赛生物技术研究所)产品,增菌培养基为北京陆桥生物技术有限公司生产。 　　1.3主要仪器设备 　　Basic Panoramic 型均质器(西班牙IUL),DeltaDilutor型精密电子稀释器(西班牙IUL),S1000TM Thermal Cycler PCR 反应仪(美国BioRad 公司),DYCZ-20A型DNA序列分析电泳仪(北京市六一仪器厂)。 　　1.4试验方法 　　1.4.1PCR引物的设计与合成。从GenBank中获取各种不同来源地LM 的-hlyA基因序列,应用PrimerExpress软件分析