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分离以苯为碳源的微生物 0前言 苯是一种无色、有芳香味的碳氢化合物，透明、易挥发、易燃、易爆。苯的中毒原理为由呼吸道侵入人体。吸入高浓度的苯蒸气以及大量苯液污染皮肤或误服均可引起急性中毒。其毒性作用是抑制中枢神经系统，另外对造血、呼吸系统也有损害。有些被苯污染的物品对人的健康构成威胁，我们可以通过不同的方法清除被污染物上的苯。而其中生物方法也是近来研究的热点，通过接种以苯为碳源的微生物。 一、基本原理 在自然条件下，微生物通常不是单独存在。从自然界混合的微生物群中分离出单一的菌种，这种获得单一菌种纯培养的方法称为微生物的分离。分离之后，需要作进一步的纯化工作才能得到理想的单一菌种。 菌株分离就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。 为了获得某种微生物好的纯培养，可采用下列方法：提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件，并可在培养基上加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长。然后再通过适当的分离技术，使之在固体平板培养基上形成单一的菌落，从而获得我们所需要的菌种的纯培养。所谓接种，就是将一定量的纯种微生物在无菌条件下，转移到另一已经灭菌，并适于该种微生物生长繁殖的培养基中的过程。为了获得微生物的纯培养，要求一切接种工作必须严格执行无菌操作程序。一般应在无菌室的火焰旁或超净工作台上进行。 二、方法与步骤 1采样 从被苯污染的土壤中取样，从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。 采样方法：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。 2 富集培养 富集（enrichment）培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。 将采到土样在富集柱上驯化，不断提高土中的苯浓度，使苯降解菌在数量上占优势。 经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡，富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。 选择培养基包括：基础培养基：(NH4)2SO4 2.0g MgS04·7H20 0.2g NaH2PO4·H2O 0.5g CaCl2·2H20 0.1g K2HPO4 0.5g 蒸馏水 1000ml 碳源：苯 浓度为0.5％-1％。 取适量富集土样在以苯为惟一碳源和能源的无机盐培养基中培养，设对照，生长后测富集液的降解效果。如果好，再适量转接到另一瓶以苯为惟一碳源和能源的无机盐培养基中培养，不断重复，直至获得高效的富集液。要注意富集过程中出现的现象变化。 3微生物的分离 纯种分离和性能测定。将高效富集液进行稀释涂布，从中挑取单菌落并验证功能，方法是用苯为惟一碳源和能源的无机盐培养基培养，测定其降解效果，找到高效降解菌。 稀释涂布法：把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浊液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养，土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少。 4验证 进一步验证，并进行传代试验，至少连续30代功能不丧失。 传代培养中，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和菌不断分裂，一则菌之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代或者再培养。 在以苯为唯一碳源的培养基上培养得到的菌种，并定时取样检测培养基上苯的含量，记录测量值，以苯含量为纵坐标，时间为横坐标绘图，观察苯含量是否下降，若下降，下降速率如何。传代培养，连续培养30代，观察其功能是否丧失。 由此可获得以苯为碳源的微生物。 流程图 验证采样 验证 采样 分离 富集 参考文献： 1、《工业微生物产生菌