免疫斑点试验.ppt

* 免疫酶斑点试验 Dot-ELISA 实验目的 2.了解免疫酶斑点技术的用途。 1.了解免疫酶斑点技术的基本原理及方法； 免疫斑点酶技术的原理 硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力, 在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。 将免疫物质吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。 免疫酶斑点技术的特点 1. Ag-Ab反应—高特异性 2. 酶催化作用的高效性—高敏感性 3. NC膜的运用—微量抗原的检测 1. 分组为单位 (两桌为一组) 实验方法及注意事项 2. 膜片、抗原、洗涤液、吸水纸在实验台上 3. 酶标抗体放置在冰箱，使用前取出 4. 底物临用前配置 5. 震荡器全班一台, 调整好频率后不要乱动 方法(直接法) 1. 取硝酸纤维素膜片, 用笔做好标记方便加样; 2. 将稀释的抗原液2μl加于相应格内,室温自然干燥! 3. 将膜片放入封闭液中震荡封闭15分钟; 4. 用洗涤液震荡洗3次, 每次1分钟, 吸干; 5. 将膜片放入稀释好的酶标抗体液体中，震荡15分钟, 吸干; 6. 将膜片放入洗涤液中, 震荡涤洗3次×1分钟, 吸干; 7. 将膜片放入底物液中, 震荡15分钟左右观察。 明显棕色斑点者为阳性 实验结果 免疫斑点试验的影响因素 2. 酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。 1. 包被NC膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500～1000μg／ml为宜。浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。 3. 显色时间，一般认为5-10分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。 4. 用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般5～10μl即可。 *