云生毛茛ISSR-PCR体系优化与引物筛选-中国科学院西北高原生物.PDF

生物技术通报 ·技术与方法· BIOTECHNOLOGY BULLETIN ( ) 2016, 32 9 :65-71 云生毛茛 ISSR-PCR 体系优化与引物筛选 1，2 1 1，2 1，2 3 1 1 石琳   胡延萍  王建科   王钧   许小宁  李毅  王莉  （1. 中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810001 ；2. 中国科学院大学，北京 100049 ；3. 青海省县镇企业技术组厂站，西宁 810008） 摘 要 ： 旨在建立稳定可靠的云生毛茛ISSR-PCR 反应体系。采用正交试验设计方法，对影响云生毛茛ISSR-PCR 扩增结果 的Mg2+ 、dNTP、Taq DNA 聚合酶、引物、模板DNA 五个因素进行优化筛选，对反应程序进行优化，建立适用于云生毛茛的最佳 反应体系和扩增程序，并对反应体系和扩增程序进行验证 ；在此基础上筛选多态性好的ISSR 引物，采用梯度法筛选各个引物的最 适退火温度。结果表明，云生毛茛20 μL ISSR-PCR 的最佳反应体系为 ：模板DNA 30 ng，Mg2+ 1.95 mmol/L，Taq DNA 聚合酶0.04 U/μL，dNTP 0.150 mmol/L， 引物 0.5 μmol/L ；最佳反应程序为 ：94℃预变性5 min ；94℃变性20 s，49.6-60.6℃复性1 min，72℃延 伸100 s，38 个循环；72℃下延伸6 min。在优化的反应体系和反应程序条件下，从 100 条ISSR 引物中筛选获得16 条ISSR 扩增引物， 并确定了引物各自的最适退火温度。经过不同居群云生毛茛的验证，证明优化后体系扩增条带清晰且重复性好，可用于后续云生 毛茛遗传多样性的研究。 关键词 ： 云生毛茛 ；ISSR-PCR ；正交实验设计 ；体系优化 ；引物筛选 DOI ：10.13560/ki.biotech.bull.1985.2016.09.010 - Optimization of ISSR PCR Reaction System on Ranunculus nephelogenes var. nephelogenes and Primer Selection 1，2 1 1，2 1，2 3 1 1 SHI Lin HU Yan-ping WANG Jian-ke WANG Jun XU Xiao-ning LI Yi WANG Li （1. Northwest Institute of Plateau Biology ，Chinese Academy of Sciences ，Xining 810001 ；2. University of Chinese Academy of Sciences ， Beijing 100049 ；3. Technology Extension Stations of Township Enterprises of Qinghai Province ，Xining 810008 ）