东亚三角涡虫Djplac8基因的结构、进化和功能研究-生物学专业论文.docxVIP

摘 要 妊娠特异蛋白 8（Placenta special gene 8, Plac8）又称 onzin 或 C15，广泛分 布于真核细胞，如酵母的 OmFCR 蛋白，植物的 PCR（proteins conferring cadmium resistance）家族和 FW2.2（fruit weight）蛋白以及哺乳动物的 onzin 蛋白。但有 关 Plac8 的研究并不多，具体结构也不清楚，只知道是一种富含半胱氨酸的蛋 白，其功能在哺乳动物中涉及细胞癌化，细胞凋亡和细胞分化的调控，最近发 现其在免疫系统的调节过程中也发挥重要作用。虽然 PLAC8 在哺乳动物中研究 较多且参与动物的许多重要的生理活动，但在无脊椎动物中 PLAC8 研究较少。 无脊椎动物中是否存在该蛋白，若存在其功能如何，目前还不清楚。 东亚三角涡虫 (Dugesia japonica) 作为扁形动物的典型代表，具有许多生物 演化进程的过渡性特征，首次出现了两侧对称和中胚层，具有极强的再生能力， 不仅成为研究动物进化、发育、免疫和再生的重要模式动物，也是研究整个生物 进化史所不可或缺的重要环节。本文从东亚三角涡虫的 cDNA 中获得一段含 Plac8 保守域的片段，通过 RACE 技术获得了该基因的全长序列约 634 bp，将其 命名为 Djplac8，并对其结构特征，进化和功能进行了初步研究。 Djplac8 基因的 ORF 有 402 bp，编码含 15 个半胱氨酸在内的 133 aa 的多肽， 相对分子量约 15.6 kDa，并对 DjPlac8 的氨基酸序列进了化分析；基因组扩增后 发现 Djplac8 没有内含子，氨基酸序列比对以及各物种内含子外显子统计分析表 明：Djplac8 在进化早期并不稳定，但在高等动物中相对保守。 Northern 杂交鉴定了 Djplac8 在涡虫体内确实存在，大小约 0.6-0.7 kb，与 获得的 cDNA 全长基本一致；利用原位杂交技术对成体涡虫进行了 Djplac8 mRNA 的定位，结果显示 Djplac8 主要在涡虫的咽和肠表达，实时定量 PCR 检 测 Djplac8 的 mRNA 经 LPS 诱导后表达呈上升趋势；利用大肠杆菌表达 PLAC8 蛋白，将蛋白纯化后制备抗体，利用 Western Blot 进行了鉴定，切片免疫组化 对 PLAC8 蛋白进行定位，结果显示 PLAC8 主要在涡虫的表皮、咽和肠表达， 这与 mRNA 表达分布一致；Western Blot 检测涡虫的 PLAC8 蛋白在 LPS 诱导后 同样表达量升高，进一步纯化研究发现 PLAC8 蛋白复性后具有抑菌作用，证明 PLAC8 参与涡虫的清除性免疫。 为研究 PLAC8 是否参与涡虫的再生和发育。我们利用原位杂交技术检测了 再生过程和胚胎发育过程中 Djplac8 的分布情况，发现在切割 3-12 h 内 Djplac8 I  主要聚集在伤口部位，而胚胎发育过程主要伴随着咽和肠的生成过程；Real-time PCR 显示 Djplac8 mRNA 在再生过程中的含量比正常水平高很多；Western Blot 分析 Djplac8 的蛋白在再生过程中同样表达量升高；RNAi 涡虫 Djplac8 基因后 第二天涡虫从头部开始出现凋亡，表明 Djplac8 通过抑制凋亡刺激参与涡虫的 发育过程。 关键词：东亚三角涡虫；Djplac8；进化；免疫；再生；发育 II  ABSTRACT Plac8 known as placenta special gene 8, also named onzin or C15, exists in almost all Eukarya, like protein OmFCR in yeast，protein PCR（proteins conferring cadmium resistance）and FW2.2（fruit weight）in plants and onzin in mammals. However, Plac8 has been rarely studied, and its structure is not clear. We only know that it is a cysteine-rich protein, which is involved in the regulation and control of cancer, cell apoptosis and differentiation. It was recently found that it also plays an important role in the modulation of immune