飞蝗几丁质酶1抗体制备及表达特性分析-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2018,51(12):2418-2428 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.12.018 飞蝗几丁质酶5-1抗体制备及表达特性分析 1 1,2 1,2 1,2 1,2 1 1,3 1 1,2 1 张婷婷 ，柳伟伟 ，高璐 ，李任建 ，付穗业 ，刘晓健 ，李大琪 ，刘卫敏 ，董卿 ，张建珍 1 2 3 （山西大学应用生物学研究所，太原 030006 ； 山西大学生命科学学院，太原 030006 ； 山西省农业科学院植物保护研究所，太原 030031 ） 摘要：【目的】通过制备飞蝗（ Locusta migratoria ）几丁质酶5-1（LmCht5-1 ）的多克隆抗体，建立飞蝗体 内 LmCht5-1 蛋白水平检测方法，分析 LmCht5-1 在 4 龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用 MEGA 软件对 LmCht5-1 和 LmCht5-2 氨基酸序列进行比对，利用 Expression 网站对 LmCht5-1 氨基酸序列进行抗原表位预测分 析，获得LmCht5-1抗原结构区域；以飞蝗cDNA为模板，通过PCR扩增 LmCht5-1 的抗原片段；同时通过酶切连接 构建含有鸡血清白蛋白 OVA 的载体 pET32a-OVA；然后通过酶切连接将 LmCht5-1 插入到 pET32a-OVA 载体构建 pET32a-OVA-LmCht5-1；将 pET32a-OVA-LmCht5-1 转入表达菌株 BL21（DE3）中，IPTG 诱导表达重组蛋白 OVA-LmCht5-1；利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔，制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价；利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮，采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞 蝗注射dsLmCht5-1，检测蛋白水平LmCht5-1 表达量，并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结 果】通过 LmCht5-1 和 LmCht5-2 序列比对和抗原表位预测分析，获得 LmCht5-1 的 471—533AA 可作为抗原区域； 通过酶切连接分别获得pET32a-OVA和pET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1， 分子量为71.34 kD；免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1，ELISA检测效价为1 ﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1 用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1，与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot 方法检测 4 龄若虫各日龄表皮中 LmCht5-1 蛋白的表达，发现 LmCht5-1 蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加，在蜕皮当天达到 峰值，蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射dsLmCht5-1，检测到在N4D5时，LmCht5-1 的转录水平和蛋 白水平均被显著抑制，抑制率分别为 70.0%和 73.6%。选取注射 dsLmCht5-1 和 dsGFP 的 4 龄飞蝗表皮，进行免疫 组化实验显示 LmCht5-1 定位于表皮细胞和旧表皮中，其功能失活引起旧表皮中几丁质不降解。【结论】获得飞蝗 LmCht5-1多克隆抗体可特异性识别LmCht5-1，可用于Western blot和免疫组化检测。明确LmCht5-1 在飞蝗4龄 若虫蜕皮当天表达最高，定位于表皮细胞和旧表皮中。dsLmCht5-1 可减少表皮细胞和旧表皮中LmCht5-1的表达， 阻碍旧