漆斑菌Myrothecium sp.IMER1液体与固体发酵产胆红素氧化酶分析.docVIP

漆斑菌Myrothecium sp.IMER1液体与固体发酵产胆红素氧化酶分析 　　摘 要：为了提高漆斑菌Myrothecium sp.IMER1的胆红素氧化酶（bilirubin oxidase，BOX）产量，分析了其液体和固体发酵产酶的特性。首先分析了该菌株液体和固体发酵产BOX的时间变化曲线，对其所产的胞外酶进行了活性电泳，进一步分析了其液体产酶的模型和宏观动力学内容。结果表明，菌株IMER1在液体发酵中第5天的产BOX酶量最大，其固体发酵产酶量最大时间也是在第5天，但是，其固体发酵能持续高产BOX。从BOX的底物活性显色中可知，在固体和液体发酵的粗酶液中都能检测到BOX，并且没有同工酶出现；而BOX生物合成模式为中期合成型，通过数据计算和模拟得出了产酶动力学方程。 　　关键词：胆红素氧化酶；漆斑菌；液体发酵；固体发酵 　　中图分类号：TQ925 文献标识码：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2015.09.005 　　胆红素是一类线形四吡咯衍生物。在人体内，如果不能及时去除由于血红素降解而产生的胆红素，那么，过多的胆红素不仅会使皮肤变黄，产生黄疽，而且还具有明显的神经毒性，会导致耳聋、精神迟钝和大脑麻瘅，严重时还会致死。胆红素氧化酶（bilirubin oxidase，BOX，EC.1.3.3.5）是一种含铜的多酚氧化酶，它能催化胆红素氧化，而且氧气是其电子受体，具体的反应过程为BOX催化胆红素生成胆绿素，后者可进一步氧化，最终生成性质还不清楚的无色化合物。最早，BOX是在荷兰猪脑中被发现的，随后又发现了多种真菌，比如食用双孢蘑菇、青霉属和漆斑菌属也能分泌该酶。但是，自从日本学者发现漆斑菌属能高产BOX后，在临床医学中，开始尝试使用该酶来测定胆红素。这种方法具有特异性、灵敏高和操作简便等优点，适用于临床手工或自动化检测中。近年来，BOX的应用领域逐渐拓宽，被用于生物电池的制造、污水处理等研究中。最近也有文献报道指出，芽孢杆菌的孢子外壳蛋白也具有BOX活性，但是，细菌的BOX氧化能力比真菌的氧化能力要低，所以，工业生产BOX还是以漆斑菌发酵产酶为主。鉴于BOX应用范围的日益广泛，对其酶的需求量也在逐年提高，而如何改善漆斑菌发酵产BOX的能力，是目前面临的一大难题。在前期实验中，筛选到了一株能产生BOX的漆斑菌（Myrothecium sp.IMER1），本文拟通过分析其液体和固体发酵产酶的相关特性，为提高菌株IMER1产BOX的能力打下坚实的基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料和主要仪器 　　供试菌株 IMER1（Myrothecium sp.IMER1）；2，2-连氮-双-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵（ABTS，美国SIGMA公司）；马铃薯液体培养基（PDB）：马铃薯20%（削片煮水），质量分数为2%的葡萄糖；固体培养基：麸皮5 g，水15 mL。 　　UNICO-UV-2000型紫外可见分光光度仪（上海尤尼柯仪器有限公司）；TGL-16/TGL16台式高速冷冻离心机（湖南湘仪集团）；ZD-88全温气浴振荡摇床（金坛市成辉仪器厂）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 液体培养 　　通常情况下，IMER1菌株的PDA斜面种5～7 d便可产生大量的分生孢子，用适量的蒸馏水将试管中的孢子冲洗出来，利用显微计数，将孢子数量调整到1×108/mL，用前将孢子悬浮液摇匀。用移液枪吸取1 mL孢子液注射入灭菌后100 mL的液体培养基中，将接种的培养基放在摇床中，在150 rpm下振荡培养。菌株IMER1在液体基质中培养一段时间后，将菌丝过滤即可得粗酶液。 　　1.2.2 固体培养 　　用移液枪吸取上述配制好的1 mL孢子液，将其注射入灭菌后的固体培养基中，然后放入恒温培养箱中培养（27 ℃）。菌株IMER1在固体培养基中培养一段时间后，加入50 mL的蒸馏水，然后振荡3 h，再过滤收集粗酶液。 　　1.2.3 酶活测定 　　ABTS法参见参考文献。在3 mL反应体系中，含有2.7 mL pH为4.5、物质的量浓度为0.2 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液，0.1 mL的酶液，物质的量浓度为1 mol/L的 ABTS0.2 mL，按次序混合并摇匀，30 s后开始记录A420，每隔15 s记1个A420值。1个酶活力单位（U）在上述条件下，每分钟催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量。 　　1.2.4 活性PAGE电泳 　　将玻璃板、胶垫和梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制质量分数为12%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶。在配制过程中，不加入SDS，样品不需要加热变性。加入了电极缓冲液后，将样品（发酵液）用微量进样器点入点样孔底部，60 V