流式细胞术实验方法及应用课件.ppt

收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 置 4℃ 冰箱中 沉淀 取底部10-20ml PBS洗 3 次 300目尼龙滤网过滤 单细胞悬液 收集方法、沉淀时间 胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝 素液，置于4℃ 冰箱中静置 6-12h 尿 液：收集24h 尿液，置4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内置 6-12h 五、荧光标记 主要包括间接免疫荧光染色和直接免 疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一 抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加 入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原--抗 体--抗体复合物。其操作复杂、费时，目前 很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直 接抗体，只能采用此方法。 直接标记是在标记时加入连接着荧光素 的特异性抗体，该方法简单，目前广泛应用 于各实验室。 羊抗兔 兔抗小鼠 小鼠 直 标 间 标 根据细胞部位的不同，可分为细胞表面和细胞内抗 原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤 1.细胞表面抗原的标记法（外周血为例 ） 全血50ul（5×105）+10ul相应抗体→避光孵 育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次 →上机分析（1% 多聚甲醛固定）。 2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 室温，15 min洗涤 去固定液 破膜剂B及抗体 室温，15 min PBS洗涤1次 上机分析（1% 多聚甲醛固定）。 3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记 在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂： 0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、 商品化固定破膜剂（A、B）。 1、空白对照 用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验 2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时，可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细胞。 六、荧光染色对照设置(空白对照 、阳性对照、阴性对照、  同型对照 ) 3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE 七、荧光补偿 流式细胞分析中常需要两种或两种以上不同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补偿。 八、数据分析 流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意门和四象门等。 任意门、矩形门 　　 线性门 四象门 多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。 淋巴细胞 T淋巴细胞（CD3+） CD3+CD8- IFN-r IL-4 （CD4+） 数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为单参数直方图和双参数散点图。 参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反映细胞颗粒性程度大小。 单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数； 双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度. SSC FSC 　　　 九、流式细胞术的应用及标记方法 1、DNA含量分析 意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C） G2/M期（4C）。