发酵灭菌、染菌知识(理论篇)课件.ppt

染菌罐的判断方法 以无菌试验中的酚红肉汤培养和双碟培养的反应为主,以镜检为辅。每个无菌样品的无菌试验，至少用2只酚红肉汤或斜面同时取样培养。要定量或用接种环蘸取法取样，公司现阶段基本都直接从发酵罐直接取样。因取样量不同,影响颜色反应和浑浊程度的观察。如果连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化或产生浑浊,或斜面连续3个时间样品长出杂菌即判断为染菌。有时酚红肉汤反应不明显,要结合镜检确认连续3个时间样品染菌，即判为染菌。各级种子罐的染菌判断亦参照上述规定。 对肉汤和无菌斜面的观察及保存期的规定,发酵培养基灭菌后应取无菌样，以后每隔8小时取无菌样一次，直至放罐。无菌试验的肉汤和双碟应保存并观察至本罐批放罐后12小时，确认无杂菌污染后方可弃去。无菌检查时间应每6小时观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。 染菌率的统计 以发酵罐染菌罐批(次)为基准, 染菌罐批(次)应包括染菌重消后的重复染菌的灌（批）次在内。发酵总过程(全周期)无论前期或后期染菌,均作“染菌”论处。 发酵罐染菌罐批(次) 染菌率(％)＝－－－－－－－－－－X100% 总投罐批(次) 染菌后的处理 污染杂菌的处理 发酵罐污染杂菌后,依据染菌时间、所染杂菌的危害性及时进行处理,同时对所涉及的设备也要及时处理 种子罐染菌后都不能往下道工序移种,要及时用高压蒸汽直接灭菌后经过滤处理放下水 发酵罐染菌的处理 发酵罐前期染菌,污染的杂菌对产生菌的危害性大,采用蒸汽灭菌经过滤处理后放掉;如果危害性不大,可用重新灭菌、重新接种的方式处理,如营养成分消耗较多,可放掉部分培养液补入部分新培养基后进行灭菌,重新接种；如污染的杂菌量少且生长缓慢,可以继续运转下去,但要时刻注意杂菌数量和代谢的变化。在发酵的中后期染菌,一是加入适量的杀菌剂,如呋喃西林或某些抗生素,抑制杂菌的生长。二是降低培养温度或控制补料量来控制杂菌的生长速度。如果采用上述两种措施仍不见效,就要考虑提前放罐 染菌后的设备处理 染菌后的罐体用甲醛等化学物质处理,再用蒸汽灭菌〈包括各种附属设备〉。在再次投料之前,要彻底清洗罐体、附件,同时进行严密程度检查,以防渗漏。染菌后的处理尤为重要，很多大面积染菌都是由于处理不彻底而造成的系统污染，造成无法及时处理好各个环节出现连续污染。 污染噬菌体的处理 抗生素等产品发酵过程中有时出现噬菌体污染,轻者造成生产能力大幅度下降,重者造成停产。 一般噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀,泡沫增多,早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶,最后仅残留菌丝断片,平皿培养出现典型的噬菌斑,溶氧浓度回升提前,营养成分很少消耗,产物合成停止等现象。 发酵过程中污染噬菌体后，一般做如下处理：1.发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉,严防发酵液任意流失；2.全部停产,对环境进行全面的清洗和消毒,断绝噬菌体的寄生基础；3.更换生产菌种,不断筛选抗噬菌体菌种,防止噬菌体的重复污染。 污染烈性噬菌体时出现上述现象。如果污染温和噬菌体时,其反应温和,平皿培养不出现明显的噬菌斑,只出现部分菌体自溶,生化指标变化不显著,生产能力降低,对生产的危害亦是严重的,但不易被发现。防止温和噬菌体污染的方法同上所述。 染菌原因分析 从染菌的规模和时间分析 在发酵过程中,如果是种子罐和发酵罐同时大面积染菌,杂菌的主要来源可能是空气净化系统,如空气过滤器失效或空气管道渗漏造成的。其次考虑种子制备工序。如果只是发酵罐大面积染菌,除考虑空气净化系统带菌外,还要重点考查接种管道、补料系统。发酵培养基采用连续灭菌工艺时,还要严格检查连消系统是否带入杂菌。 如果是部分发酵罐在发酵早期染菌,可能是培养基灭菌不彻底,或种子罐带菌,或接种管道灭菌不彻底造成的。如果是发酵的中后期染菌,重点分析补料系统和加消沫剂系统，个别发酵罐连续染菌,就从单个罐体查找杂菌来源,如罐内是否有“死角”或冷却系统有渗漏。当然还要检查附件,个别罐批的散在性染菌,其原因很难追查,要具体情 从杂菌类型分析 发酵过程染菌,多种菌型出现的机率多,单菌型机率较少。染的是耐热芽孢杆菌时,这与培养基灭菌不彻底或设备内部有“死角”关系甚大。空气中也存在芽孢杆菌,污染的杂菌是不耐热的球菌或杆菌时,可从空气净化系统和冷却系统进行追查。 制服染菌的要点 1.种子带菌或怀疑种子带菌 9.64 8.接种管穿孔。 0.29 2.接种时罐压降至大气压力 0.19 9.阀门泄漏 1.45 3.精养基消毒不透