第13章 柠檬酸课件.ppt

柠檬酸的积累机制总结 1)由于Mn2＋缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4＋浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通； 2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。 柠檬酸的积累机制总结 3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸＝90∶3∶7； 4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累； 5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累； 6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。 柠檬酸积累的理想条件： 1、提高磷酸果糖激酶的活性 2、提高丙酮酸羧化酶的活性 3、提高柠檬酸合成酶的活性 4、抑制顺乌头酸酶的活性 5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性 6、抑制?-酮戊二酸脱氢酶的活性 7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性 柠檬酸发酵需要下述环境条件 (1)磷酸盐浓度低； (2)氮源用NH4+盐； (3)pH值低（3.0）； (4)溶氧量高； (5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。 柠檬酸发酵的产率 1.无CO2固定反应的产率 192 /( 180×1.5) == 71.1% 2.通过 CO2固定反应提供C4二羧酸（无碳原子损失） 192 / 180 == 106.6% C6H12O6 C6H8O7 (C没有增加) 可见，CO2固定反应与柠檬酸发酵的重要性 C6H8O7 H2O理论转化率：116.7% 柠檬酸发酵实验 柠檬酸发酵 一、菌种：产生柠檬酸的菌种很多，以霉菌为主，又以黑曲霉产生柠檬酸的能力较强，并能利用多种碳源，故常是生产上使用的菌种。 二、发酵机理：细胞内有三羧酸循环和乙醛酸循环；柠檬酸合成酶活力较高，而乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶可被某些因素，如金属离子的缺乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。 柠檬酸发酵 三、工艺流程： ①发酵液的pH值对柠檬酸生成影响很大；pH2~3时，发酵产物主要是柠檬酸； pH值中性或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸； ② 可往培养基中加入亚铁氰化钾或采取育种手段改造菌种，使乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶缺失或尽量降低活性，以阻碍TCA循环的正常进行，从而增加柠檬酸的积累。 四、柠檬酸发酵用原料 ????柠檬酸发酵的原料有三大类 糖质原料(甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜)、 淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、木薯等) 正烷烃类原料。? 营养物浓度对发酵的影响 对生成量和组成都有影响 黑曲霉柠檬酸发酵 蔗糖浓度15%~18%，蔗糖同化率97% 蔗糖浓度20%，只同化92% 蔗糖浓度低于10%，产柠檬酸少，积累草酸 蔗糖浓度低于2.5%，不产柠檬酸 五、柠檬酸发酵工艺? 1)?试管斜面菌种培养 ????察氏琼脂培养基：NaNO3?3g，?蔗糖20g，?K2HPO4?1g，?KCl?0.5g，?MgSO4.7?H2O?0.5g，?FeSO4?0.01g，?琼脂20g，?用水定溶至1000ml，?pH自然。? ????察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g，NaNO3?2g，?MgSO4.7H2O?0.5g，?KH2PO4?1g，?KCl?0.5g，?FeSO4.7H2O?0.01g，?溴甲分绿0.4g，琼脂20g，?蒸馏水1000ml，?pH自然。 1)?试管斜面菌种培养 ????蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g，?NH4NO3?2g， ?KH2PO4?2g， ?MgSO4.7H2O?0.25g，?FeCl3.6H2O?0.02g，?MnSO4.4H2O?0.02g，?麦芽汁20ml，?琼脂20g，?用水定溶至1000ml。? ????米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水，于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。 2)??种子扩大培养? ①??二级扩大培养 a?培养基? ????有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成如下：麦芽汁7?BX，氯化铵2%，尿素0.1%，???? 2)??种子扩大培养? ①??二级扩大培养 b??培养? 固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面