链激酶的研究进展课件.pptVIP

* 链激酶的研究进展 一、背景 血栓栓塞性疾病的致残率和病死率都很高,严重威胁人类生命和健康。溶栓治疗是治疗血栓疾病的有效手段,因此溶栓药物的研究进展非常迅速,大致有三个阶段: (1)第一代溶栓剂:以链激酶、尿激酶为代表,第一代溶栓剂在临床治疗中的应用使血栓性疾病的病死率明显降低,但它们存在着许多的缺点,主要是没有溶栓特异性,过多的降解了纤维蛋白原,导致出血等严重不良反应。 (2)第二代溶栓剂:以组织纤溶酶原激活剂和单链尿激酶为代表,两者均有一定程度的纤维蛋白特异性,但它们依然存在半衰期短等缺点。 (3)第三代溶栓剂:利用基因工程技术、蛋白质技术和单克隆抗体技术对第一代和第二代产品进行改造而制成的新型纤溶酶源激活剂产品。此类药物在特异性、半衰期、溶栓效率等方面进行了改进和提高,但目前大多处于实验阶段。 二、链激酶简介 链激酶(streptokinase，SK)是由 溶血性链球菌的A、C、G族产生的机体由血纤维蛋白酶原(plasminogen，Pg)最有效的活化剂之一。 只有病原性的A、C、G族链球菌的染色体上才具有SK基因 。并不是所有的A族都能产生有活性的细胞外sK蛋白。不同来源的SK 基因具有广泛的异源性，A族和C族链球菌的SK基因在棱苷酸序列上只具有90%的同源性。即使在同一族内(A族)相同和不同血清塑菌株间也有显著的异源性。这种基因水平上的异源性导致了蛋白质水平上免疫学和化学性质的差异性。 链激酶的研究历史 1933年Tillett等发现β-溶血性链球菌的培养滤液能产生一种可以溶解人血凝块的物质。1945年Christensen等发现该物质能激活纤维蛋白酶原转变为纤维蛋白酶,因而命名为链激酶。1972年Reddy阐明了SK的作用机理。1984年,Malke等从C. S. equisimilis中克隆得到了skc的基因。1995年Young等发现切除SK分子N端的15个氨基酸后比整个长链的SK分子更容易在大肠杆菌中表达。2003年LakshmiV等对SK的氨基末端的159残基进行了研究分析,结果表明SK在无纤维蛋白作用下通过非蛋白质水解来激活底物Pg。2005年Ronald R Bean等研究了SK的α区域的作用,它能激活Pg中的Glu, Lys及Pm的Lys荧光素标记。 三、链激酶的作用机理 SK与Pg形成等克分子的复合物，此复合物本身便是游离Pg分子的活化剂，其具体过程 如下： Pg+SK SK-Pg复合物 Pg+SK-Pg 血纤维蛋白溶酶 SK-Pg+SK-Plg SK血纤维蛋白溶酶 链激酶的作用原理是激酶能将纤溶酶原激活为纤溶酶, 使具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶能降解构成血栓骨架的纤维蛋白, 从而起到溶解血栓的作用。链激酶不能直接使纤溶酶原激活, 而是和Pg形成1: 1的等分子复合物, 使纤溶酶原发生构象改变,从而暴露出活性部位, 该活性部位催化纤溶酶原转变为纤溶酶 。 纤溶酶有两个作用: 一是迅速降解纤维蛋白原成小分子产物, 这些降解产物不能参与血纤维网的形成从而阻碍血栓的形成; 二是纤溶酶可以直接降解纤维蛋白, 引起血栓溶解。 + 纤溶酶原 r-SK SK纤溶酶原复合物 纤溶酶 纤溶酶原 被溶解 血管再通 血栓 SK 被溶解 四、链激酶的修饰 Pizzo用羰基二酰亚胺唑(1，1 ，_carbonyldiimidzazole)活化PEG，然后将其偶联到sK蛋白Lys残基的ε-NH2上，反应机制如下图： 结果发现PEG—SK几乎不被人抗SK抗体所识别，而且PEG—SK的半衰期也大大地延长了。因此从功能性来衡量，PEG—SK不仅具有SK所具有的全部生物学活性，而且在许多方面还优于SK，所以修饰的SK便能很好地用于溶血栓疾病的治疗。 五、重组链激酶及其三种突变体的活性研究 （1）SK及其三种突变体基因的克隆 （2）SK及其三种突变体在大肠杆菌中的表达的表达及其分离纯化 （3） SK及其突变体的活性比较 （1）野生型SK基因的克隆 根据已经发表的SK基因设计引物，对链球菌基因组进行PCR增,测序获得ska基因序列，根据测得ska序列设计引物进行PCR，产物经电泳分离纯化后,直接连接到pGEM-T质粒上,大量扩增后再用NdeI/BamHI切下ska,连接到经同样酶切的pET-15b上,构建表达野生型SK的表达质粒pSK,酶切鉴定。 表达SKΔC42质粒的构建 根据所测ska的序列设计引物通过PCR扩增出编删除SK C-末端的42个氨基酸残基所得的突变体(SKΔC42)的基因skaΔC42,克隆pGEM-T载体上,再用NdeI/BamHI从上切下该基因,并连接到pET-15b上,构建表达SKΔC42的表达质粒pSKΔC