《生物化学技术3吸附层析》课件.ppt

（三）装柱 1.干法装柱 直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂 此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀 2.湿法装柱 先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图3-5）；待其自然沉淀至柱高的1/4 ~ 1/3 时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用2~3倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡 注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡 （四）上样和洗脱 ①经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品液体积应小于床体积的1/2）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通，分级收集 ②将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成分能完全分离（图3-7） ③为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度下降） ④分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存 加 样 操 作 示 意 图 （五）柱子再生 各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异 (1)纯化生命物质[72]： 天然的双链(ds)和热变性单链(ss)小牛胸腺DNA在HA层析柱的分离图谱 六、实例应用 (2)分离蛋白质的亚基[114] 14C-组氨酸标记的兔球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱 第二节 薄 层 层 析 薄层层析(thin layer chromatography，TLC)是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法 薄层层析的概念 1．展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需15~60min 2．设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备 3．温度变化和溶剂饱和程度对Rf值影响较小 4．可使用腐蚀性显色剂(用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固定相的薄板除外) 5．灵敏度高 薄层层析有以下优点 第三节 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸以及DABTH-氨基酸1）时，具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优点，它超过了这类化合物过去使用的纸层析、纸电泳和薄层层析(茚三酮法)等方法 一、聚酰胺薄膜层析的概念 1．用DNS—氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端 二、应用实例 2．用DABTH—氨基酸的薄层法分析蛋白质序列 谢谢使用！ * 掌握吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法 * 层析方法的类型 * 加样操作示意图 第三章 吸 附 层 析 层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的 层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法 吸附层析（absorption chromatography）又称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法 吸附层析的概念 目 的 掌握 吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法 层 析 方 法 的 类 型 第一节 吸 附 柱 层 析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相制备成色谱柱，以有机溶剂或缓冲液为流动相，用于分离纯化的一种层析方法 吸附柱层析的概念 吸附层析的固定相 极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性：如活性碳等 流动相通常为有机溶剂或缓冲液 一、常 用 术 语 1．固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用 2．流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层析中又称为展开剂 3．层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换，最终使混合物得