除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸dNTP外.PPT

将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排列顺序。 DNA 序列测定方法： 1. Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反应。 3.自动测序法。 Sanger 电泳检测--310 电泳检测--3100 步骤１：毛细管灌胶 步骤２：样品盘移动 步骤３：电进样及电泳 步骤４：荧光激发及检测 补充：测序及连接方法的遴选 对文库中的各片段逐一测序，测序后的连接则是一个巨大的任务（生物信息学）。目前有两种思路： 1. 第一种是全基因组散弹法（whole genome shut-gun)：即从文库中随机取，然后分析，分析后再根据碱基序列进行拼接，由Celera提出。 步骤： 取全基因组DNA → 纯化酶切或超声波打断 → 电泳 → 回收DNA片段 → 构建质粒文库 → 转化宿主菌 → 扩增培养 → 提质粒DNA为模板进行PCR测序 → 上测序仪 → 处理测序数据 → 补缺 → 完整基因组序列。 ⑴. shutgun法 2. 层次散弹（hierarchical shutgun） 第二种是层次散弹（hierarchical shutgun）。即把大的基因组先进行分层，如染色体编号、染色体下片段编号、小片段上作物理标记，然后再对小片段测序，这样使最后“拼接”变得容易得多。 化学修饰法的待测DNA片段有的是双链，有的是单链DNA。在进行碱基特异性化学切割反应前，首先对待测DNA片段作末端标记，使其末端(5′端或者是3′端)带上放射标记。如果待测DNA是双链，必须使其形成末端标记的单链。 对末端标记的DNA链进行化学断裂反应分两步进行： 第一步是在4个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸对特定的碱基进行化学修饰； 第二步是以六氢吡啶取代被修饰的碱基并将DNA链断裂。 DNA化学裂解反应体系 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C和T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C DMS（硫酸二甲酯）在中性pH环境中，主要作用于G，被六氢吡啶作用而造成该位点上DNA链的断裂。 甲酸具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点(G和A)发生断裂。 肼，在碱性条件下，作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于胞嘧啶。 在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。 以上4种反应体系DNA片段混合物经高分辨凝胶电泳与放射自显影，便可直接读得测定DNA片段的碱基排列顺序。各DNA子片段测序工作完成后，按酶切图谱，可顺序相连完成完整的长链DNA序列。 5′— GATCACTACTG —3 ′ 标记 5′— *GATCACTACTG —3 ′ G：DMS C：肼（加盐） G+A：甲酸 C+T：肼 5′-*GATCACTACTG 5′-*G G 5′-*GATCACTACTG 5′-*GATCACTA 5′-*GATCA 5′-*GA 5′-*G 5′-*GATCACTAC 5′-*GATCACT 5′-*GATCAC 5′-*GATC 5′-*GAT 5′-*GATCACTACT -*GATCACTACTG- 5′-*GATCACTAC 5′-*GATCAC 5′-*GATC -*GATCACTACTG- 电 泳 5′-*GATCACTACTG 5′-*GATCACTACT 5′-*GATCACTAC 5′-*GATCACTA 5′-*GATCACT 5′-*GATCAC 5′-*GATCA 5′-*GATC 5′-*GAT 5′-*GA 5′-*G C+T C G G+A 5′ 与双脱氧链终止