二、实验总要求发光细菌的获得.doc

绿色荧光蛋白实验设计报告 尤玉玲2013141241081 张帆2013141494071 实验材料： PET28a质粒 pEGFP-N3质粒 实验目的： 发光细菌的获得 实验整体思路： 大肠杆菌感受态细胞的制备 将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转入大肠杆菌 含PET28a质粒及pEGFP-N3质粒细菌的扩大培养 PET28a质粒及pEGFP-N3质粒的提取及检测 质粒及目的基因片段的酶切及检测 扩增EGPF基因及pET-28a酶切质粒 酶切质粒及目的片段的连接 重组质粒转入DH-5α扩增及菌落PCR检测 重组质粒转化BL21细胞并检测细菌发光情况 一、DH-5α 和BL-21感受态细胞的制备 将0~4 ℃保存的DH-5α 和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。 取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。 二、将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转入DH-5α 1)取制备好的感受态细胞200 μl，冰上解冻，均匀悬浮。 2) 加入2 μl目的质粒，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。 3) 42 ℃水浴2min后，冰上放置2 min。 4) 加入400μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。 5) 取200 μl悬浮细胞涂布在含kana的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培养倒置12-16 h。 三、含PET28a质粒及pEGFP-N3质粒细菌的扩大培养 1、将带有质粒pET-28a的大肠杆菌接种在LB液体培养基6ml+12μl (20mg/ml)kana中（加卡那霉素40μg/mL），37C培养12-18h。 2、LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10 g/L，琼脂糖15 g/L，PH7.5 四、PET28a质粒的提取及检测50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ 乙二胺四乙酸EDTA-Na（PH8.0）， 25mmol/L 三羟基氨基甲烷Tris-HCl (pH8.0) 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解 溶液 Ⅱ ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1等体积配制。 作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性 溶液 Ⅲ ：5mol/L 醋酸钾 60ml 冰醋酸 11.5ml 双蒸水 28.5ml 作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀 TE缓冲液：10 mmol/L 三羟基氨基甲烷Tris-HCl (pH8.0) 1 mmol/ 乙二胺四乙酸EDTA-Na（PH8.0） 提取实验步骤 取培养菌液1.5mL置Ep小管中，10000rpm×2min，弃上清液。 加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。 加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。 加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。 10000rpm× 5 min，取上清液于另一干净的离心管中。 向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm × 10 min，将上清液转移至新的离心管中。 （酚和氯仿的混合液去除蛋白） 加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀， -20C（室温）放置30min。 12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min。 加30μL TE缓冲液 ，-20C保存备用。（TE缓冲液：含有胰RNA酶，可使D