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副溶血性弧菌分子检测和分型研究进展 　　摘要 副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常通过食用被该菌污染的食品导致食物中毒。该文综述了副溶血性弧菌的分子检测技术如PCR、环介导等温扩增、免疫捕获等，及分型技术如RAPD-PCR、ERIC-PCR、PFGE、核糖体分型、RFLP等，这些方法将为副溶血性弧菌食物中毒提供重要的检测与分型手段，对预防与控制副溶血性弧菌食物中毒具有重要意义。 　　关键词 副溶血性弧菌；检测；分型方法 　　中图分类号 R378.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）22-0277-02 　　副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是重要的食源性嗜盐致病菌，可因食用被其污染的食品而引起中毒。多见于日本、东南亚、美国及中国台北地区。近年来，在我国浙江、上海、广东、福建等沿海地区各种食源性病原菌中副溶血性弧菌所占比重不断上升，已成为细菌性食源性致病菌的首位。副溶血弧菌的检测与分型技术对预防和控制该菌食物中毒具有重要意义，该文综述近年来副溶血弧菌的分子检测与分型应用进展，以供参考。 　　1 副溶血弧菌的分子检测技术 　　1.1 基于特异性毒力基因检测 　　翁仕强等[1]采用自行设计的改良初筛方案结合tlh、toxR 2种特异性基因的2次筛选开发了一种副溶血性弧菌的快速分离鉴定方法，并通过16S rRNA 基因测序进行特异性验证。Venkateswaran et al[2]克隆gyrB基因并测序，在分析序列的基础上建立了基于gyrB检测副溶血性弧菌的分子检测技术。周 燕等[3]利用tlh基因建立海产品中副溶血性弧菌的分子检测技术。该方法特异性强，灵敏度高，实验样品摇床增菌3 h，结合PCR检测，8 h可以获得样品的检测结果。张红芝等[4]建立了添加内标（IC）的PCR副溶血性弧菌分子检测技术，该方法对DNA灵敏度的检测极限是0.5 pg/μL，此时IC的最佳添加浓度是0.5 fg/μL。对多份水产品的检测结果也证实该方法能起到很好的指示假阴性作用。俞春松[5]选取副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因作为检测的靶片段设计引物及探针，通过体系优化建立检测副溶血性弧菌的荧光定量PCR检测方法，该方法具有较好的特异性、灵敏度、重复性，并对临床收集的样本进行检测。 　　1.2 免疫捕获分子检测 　　郭 川等[6]将脱毒后的副溶血性弧菌作为抗原免疫家兔，得到抗血清包被PCR管，对待检的副溶血弧菌进行免疫捕获，建立基于tlh基因的免疫捕获PCR检测副溶血弧菌技术。该检测方法能够对副溶血性弧菌进行特异性的检测，同时包被抗体的捕获对提高检测灵敏度起到一定的作用。同年，郭 川等[7]还建立了一种适用于非可培养条件（VBNC）下副溶血弧菌的免疫捕获PCR技术，制备的抗血清对非可培养条件下的副溶血弧菌具有很好的富集作用。 　　1.3 基于颜色反应检测技术 　　罗可天等[8]利用环介导等温扩增（LAMP）技术对一起食物中毒事件进行病原菌检测，同时以国标GB/T4789-2003中使用的检测方法进行平行对照实验，结果显示，18份样本中有6份检出副溶血性弧菌，LAMP检测结果与国标检测结果一致。刘 威等[9]利用DNA环介导恒温核酸扩增法（LAMP）针对副溶血性弧菌特异基因tlh基因设计4条引物，通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域来快速检测副溶血性弧菌。LAMP反应的过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁，故可以通过监测浊度来判定；如果在反应前添加羟基萘酚兰（HNB），蓝色的阳性结果很明显区别于紫色阴性结果。该LAMP方法的最低检出限为9.74 pg/μL，PCR方法最低检出限为97.4 pg/μL，LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍，且具有良好的特异性。 　　2 副溶血弧菌的分子分型技术 　　2.1 RAPD-PCR分型技术 　　利用随机排列的寡核苷酸单链（通常为8~10个核苷酸）为引物，在低退火温度下使引物与模板DNA复性，经Taq聚合酶作用扩增基因组DNA，获得基因组不同大小的DNA片段即电泳图谱，亦称随机扩增分子指纹图谱。根据扩增产生条带大小及数目的差异，可分析菌株间亲缘关系或是不同种基因间的差异，该方法具有灵敏度高、操作方便、快速等优点，但重复性及特异性还存在一定缺陷，不同实验室之间比较差异较大，容易受实验条件及操作人员影响。李孝权等[10]采用随机扩增多态性分析（RAPD）对46株副溶血性弧菌食源性疾病分离株进行分子分型，结合SPSS软件构建以上菌株的带型关系系统树状图，对菌株进行基因多态性分析，经聚类分析可分为3个主要聚类群，较好地反应了不同血清型和不同来源菌株的亲缘关系。Hara-Kudo et al[11]对副溶血弧菌流行株和非流行株进行