试验三凝集反应与沉淀反应.DOC

实验三 凝集反应与沉淀反应 一、凝集反应 【实验目的】 掌握凝集反应的概念、原理及操作方法；了解血清学的方法和原理；了解血清学方法在微生物诊断中的作用；学会利用血清稀释法测定免疫血清的效价。 【实验内容】 直接凝集和间接凝集 （一）直接凝集 【实验原理】 颗粒性抗原与相应抗体在适当条件下发生反应，出现肉眼可见的凝集小块，称为直接凝集反应。在操作方法上有玻片凝集法和试管凝集法，前者多用于细菌或ABO血型鉴定，后者可应用于抗血清的定量测定和判断患者血清中某种抗体的水平。 【试验材料】 1．标本 任一常见细菌的平板或斜面培养物；待检测血清。 2．试剂 与细菌对应的诊断血清（可用生理盐水作适当稀释，以免发生前带现象）,生理盐水、已知伤寒沙门氏菌菌体抗原悬液(7×108/ｍl)，伤寒沙门氏菌O抗血清（用生理盐水作1:10稀释）。 3．器材 载玻片 接种环 恒温水浴箱 试管架 试管 吸管等 【实验方法】 1．玻片凝集试验 ⑴在洁净载玻片一端加生理盐水一滴，另一端加诊断血清一滴。 ⑵接种环在酒精灯火焰上灭菌后，挑取细菌，分别涂布于生理盐水和待检血清中，充分混匀。 ⑶室温下静置数分钟观察结果。 2．试管凝集试验 ⑴取洁净试管9支，排列于试管架上，其中一支不标记，其余8支依次编号并作好标记。 ⑵未编号的试管中加入0.9ml生理盐水，取0.1ml待检血清，充分混匀，对待检血清作1:10稀释。 ⑶向编号的8支试管中各加入生理盐水0.5ml。 ⑷吸取1:10稀释的被检血清0.5ml，加入第1支试管中，充分混匀，吸出0.5ml放入第2支试管，混合后取出0.5ml于第3管中，如此依次类推，直至第7管，混匀后吸出0.5ml弃去。第8管中不加入待检血清，为生理盐水阴性对照。第1~7管的血清稀释度分别为1︰20，1︰40,1︰80,1︰160,1︰320,1︰640和1︰1280。该稀释方法为免疫学中常用的连续倍比（2倍）稀释法。 ⑸向1~8号管中加入诊断菌液0.5ml，此时每管的液体总量均为1.0ml，血清稀释度又增加了1倍。因此，血清的最终稀释度1~8号管分别为：1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560。 ⑹摇匀，置37℃ 2~4h后取出，放于4℃或室温过夜观测结果。 表3-1 试管凝集操作程序 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 生理盐水(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 稀释血清(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃去0.5 血清稀释倍数 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 诊断血清(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 最终稀释倍数 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 1：2560 — 【判定标准】 1．玻片凝集法 生理盐水对照不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。在诊断血清中，出现肉眼可见的凝集块，为阳性结果。如与对照侧相同则为阴性。 图实验3-1 玻片凝集反应示意图 2．试管凝集 ++++ 液体完全透明，菌体完全凝聚呈伞状沉于管底，振摇时沉淀呈片状、块状或颗粒状（100％凝集）； +++ 液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉淀管底，振荡后情况同前（75％凝集）； ++ 液体不太透明，管底有明显凝集颗粒沉于管底，振摇时有块状或小片絮状物（50％凝集）； + 液体透明度不明显或不透明，有少量颗粒状物沉于管底（25％凝集）； _ 液体不透明，管底无凝集，有时管中可能有少量均匀沉淀物，振荡后均匀混浊。 3．免疫血清效价的判定 取出现“++”以上凝集阳性的最高稀释度作为免疫血清的效价。 【实验报告内容】 1．描述玻板凝集试验中各血清凝集现象及结果。 2．比较玻板和试管凝集试验的优、缺点及其用途。 3．试述玻板和试管凝集试验操作的注意事项。 （二）反向间接凝集试验（甲胎蛋白检测） 【实验原理】 甲胎蛋白（AFP）是胎儿时期出现的一种血清蛋白，出生后血清含量极少，而原发性肝细胞癌患者血清中的AFP含量又可升高，临床上常常借助甲胎蛋白的检测作为对原发性肝细胞癌的辅助诊断。反向间接血凝试验是实验室检查AFP的方法之一，原理是将抗AFP致敏红细胞，与病人血清中的AFP相遇时，可发生凝集现象。 【实验材料】 1．诊断红细胞制品（抗AFP致敏的红细胞）生物制品所有冻干制品，试验时按使用说明所示方法稀释即可。 2．被检血清。 3．生理盐水。 4．微量滴管。 5．微量反应板 选用V形孔。 6．微型振荡器。 【实验方法】 1．稀释被检血清