人SCYLBP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定-北京玛格泰克.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（９）：１８ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 研究报告 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 人ＳＣＹＬ１ＢＰ１重组蛋白的原核表达 及分离纯化鉴定 陈晓静　陈小梅　王　洋　施慧莉　霍克克 （复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室　上海　２００４３３） 摘要　前期研究结果发现，ＳＣＹＬ１ＢＰ１具有细胞周期调控功能，同时具有肿瘤抑制因子的特性。 目的：采用基因工程技术，构建ＳＣＹＬ１ＢＰ１的大肠杆菌重组表达菌株，以获得足够量的高纯度目 的蛋白，为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法：利用从人胎脑ｃＤＮＡ 文库中克隆得到ＳＣＹＬ１ＢＰ１基因克隆为模板，经ＰＣＲ扩增，通过酶切位点克隆到新型原核表达载 体ｐＥＴ２８ｂＳＵＭＯ上，转化大肠杆菌表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３）。经ＩＰＴＧ诱导表达，摸索优化表达条件， 表达产物经Ｎｉ柱进行亲和层析纯化，后再进行 ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等分析鉴定。结果：成 功构建了ＳＣＹＬ１ＢＰ１的原核表达工程菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ｂＳＵＭＯＳＣＹＬ１ＢＰ１。ＳＤＳＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检验结果表明，诱导表达的融合蛋白Ｈｉｓ６ＳＵＭＯＳＣＹＬ１ＢＰ１的分子量约为６５ｋＤａ，主 要以可溶的形式存在，且能被Ｈｉｓ标签抗体和ＳＣＹＬ１ＢＰ１单克隆抗体特异性识别。结论：原核表 达并纯化了人ＳＣＹＬ１ＢＰ１融合蛋白，为其后续功能研究及性质实验奠定基础。 关键词　ＳＣＹＬ１ＢＰ１　重组蛋白　原核表达　工程菌　ＳＵＭＯ 中图分类号　Ｑ７８６ 　　人类 ＳＣＹＬ１基因（又名 ＮＴＫＬ，Ｎｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ 　　 人类ＳＣＹＬ１ＢＰ１基因的ＣＤＳ序列全长 １１８５ｂｐ， ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＢＥ６７５０４８）定位于 编码３９４个氨基酸。在１６种成人组织中广泛表达，其 人体染色体 的 １１ｑ１３，跨越 了两个微卫星标记 中在心脏、肝脏、胰腺、脾、胸腺、和前列腺中表达量较 Ｄ１１Ｓ４９３３和Ｄ１１Ｓ５４６之间的约 １５ｋｂ区间，一些癌症 高。前期研究结果表明： １）该蛋白主要分布在核周，少 研究中发现该区域存在染色体易位断裂，因而人类 ［６７］ 量分布核内和胞浆中 。２）该基因转染细胞后，能显 ［１３］ ＳＣＹＬ１基因被认为可能与癌症的发生相关 。ＳＣＹＬ１ 著抑制肝癌细胞株的生长与集落形成，同时具有显著 ＢＰ１是本实验室通过酵母双杂交技术首先从人胎脑 抑制荷瘤裸鼠的肿瘤形成的作用；该基因过表达会使 ｃＤＮＡ文库中克隆得到的一个能与ＳＣＹＬ１发生蛋白相 ［７９］ 细胞在Ｇ２Ｍ期的停留时间延长，抑制细胞生长 。 互作用的新基因。ＳＣＹＬ１ＢＰ１蛋白在拟南芥，黑腹果 ３）该基因的过表达能稳定Ｐ５３蛋白免于被ＭＤＭ２介导 蝇，秀丽线虫，小鼠和人类中均有表达，分析发现其在 ［８９］ 的泛素化途径降解 。４）基因表达谱芯片检测结果 ［４６］ 进化上具有高度保守性 。 还发现，当该基因被 ＲＮＡｉ抑制时，可以导致 ＮＦＢ的