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湖 南 环 境 生 物 职 业 技 术 学 院 毕业设计成果 选题名称： 快速检测HBV的PCR技术的研究 类 型：□产品设计 □工艺设计?方案设计 专 业 医学检验 姓 名： 陈聪 学 号： 201335030087 班 级： 133检验2班 指导老师： 盘箐 任务下达日期：2016年 5月 10日 设计完成日期：2016年 6 月 10日 毕业设计诚信承诺书 我谨在此承诺： 本人所呈交的毕业设计《快速检测HBV的PCR技术的研究》由本人独立完成，保证不存在任何剽窃、抄袭他人成果的现象。凡涉及其他作者的观点和材料，均作了注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的行为，由本人承担由此产生的一切后果。 承诺人（签名）：陈聪 2016年 6 月 20 日 目录 前言 1、荧光定量法检测乙肝DNA 1.1标本取样 1.2操作步骤 1.2仪器与试剂 1.3方法与研究 2. PCR荧光定量法测定乙肝DAN的结果分析 参考文献 快速检测HBV的PCR技术的研究 前言 快速检测HBV法主要为荧光定量测定法，这项测定法被广泛应用于基础研究， 成为分子生物学必不可少的研究工具。与传统的PCR技术相比，荧光定量PCR具有快速、高特异性、高敏感度的特点，所以自1985年Mullis发明PCR技术和1988年Erlich发现耐高温的DNA聚合酶以来，该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域，特别是在细胞学、病毒学、肿瘤学、遗传学、法医学、动植物免疫学等方面取得了巨大的成绩，成为当代分子生物学发展史上的一个里程碑。近年来在乙肝病毒的诊断中，它为乙肝的诊断提供了直接的依据。 1、荧光定量法检测乙肝DNA 1.1标本取样 在邵阳第一人民医院收集20份HBV－ELISA阳性标志物血清进行HBV－DNA的检测，患者年龄不等，多为孕妇和肝病患者。 1.2操作步骤 20份标本编号，拿20个子弹头提取标本，按顺序编号，每孔70μL提取液和30μL血清，混匀。再选用四个子弹头，分别编号为ABCD，依次加入质控。标本震荡10min℃温育10min，待温度降到80℃ 1.2仪器与试剂 使用5700型荧光定量PCR仪（PE，美国）、离心机（湖南仪表总厂）、NaOH（上海生工）、HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒（华美生物技术公司）。 1.3方法与研究 该试剂品基于TaqMan探针实时荧光PCR技术，在PCR反应过程中，同时利用Taq酶的5—3聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得TaqMan探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，FAM荧光检测乙型肝炎病毒，JOE\RED610nm波长通道检测内参。PCR反应的进行必须在一定的缓冲液中加入微量的模板DNA分子,四种脱氧核甘酸(dNTP)溶液,耐热性DNA聚合酶和两个特殊设计的人工合成的DNA引物后进行三种温度“变性→复性→延伸循环”,如此循环30-35次,特异DNA片断增加100万倍。扩增的产物进行荧光比色，从标准曲线查得DNA含量。 荧光定量PCR法，是最常用的检测乙肝病毒DNA的方法，能反映血液中乙肝病毒DNA存在的多少，乙肝病毒DNA检测报告单上的单位通常为 A x 10n Copies/ml(拷贝/毫升)，表示每毫升的血清中病毒基因组的个数，该数据越大，表明病毒在人体内的复制越活跃。例如乙肝病毒-DNA=5.1×103 Copies/ml代表每毫升血清中有5100个乙肝病毒。判断血清中病毒含量主要看上式中的10n ， n越大，表示含量越高。在抗病毒治疗过程中， n变小说明病毒的复制得到控制，治疗有效。通常，如果病毒含量下降至n3 ，说明病毒基本得到控制。 2. PCR荧光定量法测定乙肝DAN的结果分析 乙肝与肝硬化、原发性肝癌关系密切，因此，乙肝的诊断与防治极为重要，传统的血清学方法在乙型肝炎的诊断上发挥了重要作用。然而，在众多的乙肝患者中，约有60%为慢性肝炎患者，慢性肝炎对生命的威胁远高于急性肝炎。慢性肝炎患者的血清学指标往往显假阴性。此时检测乙肝病毒-DNA是唯一可靠的方法。另外对血清学结果模棱两可或与临床表现不符时，PCR技术有助于明确诊断。具体来说，乙肝病毒-DNA荧光定量检测的主要意义如下： （1）定量方法使全程动态观察病毒含量成为可能。乙肝病毒-DNA是乙肝病毒存在和复制的直接证据。因此，我们可通过动态检测血清乙肝病毒-DNA含量对各种乙肝病人病毒活动情况获得更真实全面的了解，使人们对乙肝的认识上升到一个更高的水平，对科研临床及流行病学研究均可提供有力的依据。