抗体标记技术汇总-讲义.docVIP

第1章 抗体分子标记技术 第一节 抗体的I125标记法 基本原理 有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α-diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。 试剂及仪器 经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1) 无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液 凝胶过滤柱 γ-记数器 100g/L 三氯醋酸 70% 乙醇 玻璃纤维滤 氯胺T (Chloramine T)反应用 * 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）； * 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS液。 操作步骤 *注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。 （一）氯胺T法 用1.5ml Ependof 管， 加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl； 加500 μCi 的Na125I ，混匀； 加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀； 在室温下培养1分钟； 加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）； 通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分； 收集、合并含碘化抗体的各管； 将125I标记的抗体管放入同位素保护管中，置4℃保存。 （二）Iodogen-包被试管法 Iodogen以0.5μg/ml溶于氯仿； 将100μl Iodogen液移入合用的玻璃试管中； 试管置通风橱中过夜，在室温下让氯仿蒸发； 加入50μl 抗体（0.2-1mg/ml在pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液中）； 加500 μCi Na125I 到加有抗体的Iodogen-包被管中，室温保温2分钟； 将管中反应液转入1.5ml Eppendof 管（其中已先加有50μl Iodogen 反应终止缓冲液），轻混； 通过凝胶过滤层析，将碘化抗体与碘化酪氨酸分离（同前络胺T法）； 收集、混合含碘化抗体的各管； 将125I标记的抗体置同位素保护管中，放4℃保存。 实验质量监测 应用三氯醋酸沉淀法测定抗体标记效率： 取两片玻璃纤维滤纸，用软铅笔写标记； 将滤纸平放在试管架的孔部，使其中心部分不接触试管架； 将1-5μl含约10000cpm 的样品，准确的点到每一张滤纸的中心，在室温下待干； 用平头镊子将一滤纸转入试管，加入2ml 100g/L三氯醋酸； 滤纸在三氯醋酸液中浸转10 分钟，倾出溶液； 再加入2ml 100g/L 三氯醋酸，重复上述操作； 加入2ml 70%乙醇，滤纸浸在乙醇中转动10 分钟后，倾出溶液； 测定经过洗过涤与未洗涤滤纸的放射性； 由所测定滤纸点样中与抗体结合的125I量，计算与抗体液中与抗体结合的125I总量。 洗后滤纸的cpm 未洗滤纸的cpm × 100 = 结合碘的比率 样品的总量/ 收集的分量× 在洗后滤纸中的cpm = 总抗体-结合放射性 *与抗体结合的同位素量应为样品中同位素总量的70-95%。 实验要点及说明 用氯胺T法进行碘化，也可在大约pH 7.0的缓冲液中进行。均必需保证反应体系中无还原剂存在。 如果氧化反应损伤蛋白质，可将氯抗体与异硫氰酸荧光素（ FITC）偶联）胺T量减少到0.02mg/ml, 并将偏重亚硫酸液的浓度降到0.024mg/ml。 Iodogen-包被的试管可在干燥器中，室温下，保存多年。 125I标记的抗体，在制备后六周内均可使用（125I的半衰期为59.6天）。 要注意保证所用的Na125I是新鲜的，陈旧制剂的比活性低。 酪氨酸的碘化偶尔会对抗原的抗体结合位点有干扰，因此降低其结合能力，但