生物系统中目标蛋白分子的分析和鉴定.pptVIP

* 生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定 生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定 三个关键问题: 目标蛋白分子病理条件下的序列变化（测序） 避免目标蛋白分子的技术性降解（-70?C条件下保存，实验操作通常在冰浴下进行，与此同时要加全蛋白酶抑制剂） 结合实验目的，选择合适的分析方法（定性与定量，相对定量与绝对定量） 生物系统中总蛋白质的定量 凯式（Kjedahl）定氮法 光吸收法 双缩脲法 福林-酚法 考马氏亮兰G-250法 氨基酸分析法 BCA法 凯式（Kjedahl）定氮法 最早的经典方法。 各种蛋白质的含氮量相对恒定，14％~16％。 计算公式：蛋白质量=含氮量/16%=6.25×含氮量。 实验步骤如下： 注意事项: 本法非常灵敏，务必避免外界氨的干扰。 一定量蛋白质 硫酸铵溶液 氨气 蛋白质含氮量 蛋白质含量 (NH4)3BO3 浓硫酸 NaOH 蒸馏 H3BO3 HCl, 滴定 指示剂 光吸收法 因为芳香族氨基酸Tryptophan和Tyrosine的存在，使得Proteins溶液在280nm呈现特征性吸收峰。以此来定量溶液中的Proteins。 一个经验公式：当Proteins溶液A280=1时， 溶液中Proteins的浓度=1mg/ml。 各种Protein所含芳香族Amino acid的含量是不同的，有时会有较大差异，因此光吸收法是一种较粗略的蛋白质定量方法。 有时Proteins样品中有Nucleic acids存在， Nucleic acids也有紫外吸收，因此会对Proteins的测定产生干扰。这时采取分别测定280nm和260nm光吸收值，并以下式计算。 蛋白质浓度（mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。 光吸收法 (continue) 最准确的办法是，首先得到Target Protein在280nm的吸光系数?，其次针对性地测定该Target Protein溶液的280nm吸光度值，最后再利用公式计算溶液中Target Protein的浓度（C=A280/?L, L：比色杯内径cm ）。 测定Target Protein在280nm的吸光系数，必须首先得到干燥的该Target Protein纯品。在105oC下恒重后，精确称量1~10mg，再定量溶于一定体积的蒸馏水中，通常浓度为1mg/ml，测定溶液280nm光吸收，计算得到吸光系数?。 双缩脲法 基于蛋白质链肽键“－CO－NH－”有双缩脲反应特性即，Proteins在碱性溶液中与Cu2＋发生络合反应显蓝色。 受Proteins特异性影响较小。 适用于较大量Proteins（mg）的定量测定。 实验操作简便。 福林-酚法 灵敏度和准确度均较高。 实验操作较繁琐。 影响因素较多，如去垢剂等。 考马氏亮兰G-250法 实验操作简便。 适合于定量10~100?g 的Proteins。 应用广泛。 测定Proteins的考马氏亮兰G-250溶液也叫作“home-made”试剂。 氨基酸分析法 通过把Proteins水解成Amino acid，然后再对Amino acid进行分析来定量Proteins。 很准确，最接近于真实值。 测定值比实际量有时会偏低。主要原因是Protein水解时，Trp被完全破坏，Cys也要遭受很大损失，Ser和Thr的回收也只有90％。 一种新的测定蛋白质的方法：BCA法 BCA法 一种新的测定Proteins的方法 灵敏度和重复性均佳。 干扰因素少。 试剂公司（Pierce）有试剂盒供应。 生物系统中某种Target Protein的定量 ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Array） Western blotting Enzyme activity 测定 夹心法（sandwich method） Antigen Antibody-1 Antibody-2 ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Array） 讨论题一： 某实验室欲建立一种双抗体夹心法，以检测人血清中蛋白A的含量。以往该实验室曾自己制备了一兔抗人蛋白A多克隆抗体，并从某公司购买了一鼠抗人蛋白A单克隆抗体。该实验室按如下方案进行预实验，结果失败了。请分析最可能的原因是……。 Antigen，人蛋白A Polyclonal antibody monoclonal Antibody *