利用SSR标记分析24份玉米自交系亲缘关系-中国种业.DOC

作者简介：郭衍龙，从事玉米育种工作。E-mail：yanlong-guo@163.com *袁国保为本文通讯作者。Tel:02786633009 E-mail：gbyuan@基金项目：科技部国际合作专项 作者简介：郭衍龙，从事玉米育种工作。E-mail：yanlong-guo@163.com *袁国保为本文通讯作者。Tel:02786633009 E-mail：gbyuan@ 基金项目：科技部国际合作专项“非洲农作物种质资源的抢救性引进与合作研究”（2011DFB31620） 郭衍龙1、2，郭承亮1、2、3，周广成1、2，袁国保1* ，耿月明1，王世才1、2，王清华1、2 （1.湖北省种子集团有限公司，湖北 武汉，430206；2.湖北禾盛生物育种研究院，湖北 武汉，430206；3.农业部籼稻新品种创制与种子技术重点实验室,湖北 武汉，430206） 摘要：利用SSR标记研究了从非洲收集的24份玉米种质的遗传多样性及类群划分。用25对扩增带型稳定的引物，从供试材料中共检测出153个等位基因变异，每对引物检测出0～17个等位基因，平均6.12个。24份供试种质的遗传相似系数变化范围在在0.44～1之间，平均为0.69。按UPGMA 方法进行聚类分析，可将其分为四大类群，其中7号可能属于新的杂优类群。 关键词：玉米种质；SSR标记；聚类分析；亲缘关系 玉米是典型的异花授粉作物，杂种优势利用是玉米育种的关键技术[1]。对玉米自交系进行亲缘关系划分，有助于避免选配杂交组合的盲目性，提高育种效率。20世纪80年代以来，育种家通过种质系谱、地理来源、表型聚类、数量遗传学方法、生理生化指标、分子标记等对生产上利用的自交系划分杂种优势类群[2]-[4]。SSR标记共显性遗传标记，具有多态性高、遗传方式简单、结果重复性好、稳定可靠、DNA需要量少等优点，能够有效的应用于玉米种质的遗传变异和类群划分[5]。马骏等利用SSR标记技术划分的种质资源类群与供试材料的系谱来源基本一致[6]。李新海[1]、袁力行[7]等也利用SSR标记技术将不同生态地区的玉米自交系划分为若干类群。 本研究运用SSR标记技术对从非洲引进的24份玉米种质进行杂种优势类群的划分，旨在克服杂交组合组配的盲目性，为这些种质的高效利用提供理论依据。 材料与方法 1.1材料 以从非洲收集的24份玉米种质为试验材料，编号为内部编号。这些种质对条锈病、普通绣病和病毒病具有较好的抗性或耐性。 1.2 SSR标记分析 采用CTAB 法提取DNA。从47对引物中筛选出扩增带型清晰稳定的25对引物，引物由武汉安基生物科技有限公司引物合成。采用10μl PCR 反应体系进行PCR扩增，反应成分包括10×buffer，150μmol/L dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，20ng DNA模板，0.2μmol/L SSR引物，反应液上加盖10μl 矿物油(Sigma)。扩增程序为94 ℃预变性5min，1 个循环；94 ℃ 变性40s ，60 ℃退火35s ，72 ℃延伸45s，共35个循环，最后在72℃延伸5min。扩增反应在伯乐双色实时定量My Cycler PCR上进行。采用Bio-Rad 测序胶板装置(38 cm ×30 cm ×0. 4 mm) 进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(4.5 %) 。在加入40μl TEMED 和400μl APS 后,立即灌胶，约30 min 后，胶凝固。安装电泳槽,倒入大约1 800 ml 1 ×TBE 缓冲液。在100W功率下，预电泳20min。PCR 产物变性后，上样3μl。在80 W功率下，电泳大约1 h。快速用水冲洗1 次，0.1 %AgNO3溶液中浸泡30 min，然后在1100ml 3 %NaOH溶液（含10ml甲醛）中显影至带型可以区分为止。在白炽灯下观察电泳结果，进行数据统计和扫描照相。 1.3统计分析 SSR 扩增产物以0、1、9 统计建立数据库。在相同迁移率位置上,有带者记为1 ,无带记为0 ,缺失数据记为9。以简单配对参数( simple matching coeffi-cient) 估计基因频率,依据公式GS=m/(m + n) 和GD=1-GS计算遗传相似系数和遗传距离,其中m 为基因型间共有带数目, n为差异带数目。按UPGMA 方法(Unweight Pair Group Method Using Arithmetic Averages) ,采用NTSYS- pc version 2.10e软件进行聚类。 结果与分析 2.1 SSR标记检测结果 用25对引物对24份玉米种质进行PCR扩增。多数引物在供试种质中扩增出1条片段，但部分引物扩增出2～3条片段，这可能因为基因组内存在多个与引