烟草尼古丁去甲基酶基因CYP82E4启动子结合蛋白的鉴定-云南大学.PDF

云南大学学报（自然科学版），２０１５，３７（１）：１４０～１４６ ＤＯＩ：１０．７５４０／ｊ．ｙｎｕ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 烟草尼古丁去甲基酶基因ＣＹＰ８２Ｅ４启动子 结合蛋白的鉴定与分析∗ １ ２ ２ ２ １ １ ２ 余玉珍 ，王丙武 ，李文正 ，高玉龙 ，张　 琦 ，陈　 奇 ，宋中邦 （１．昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明　 ６５０５００；２．云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明　 ６５００３１） 摘要：以尼古丁去甲基酶编码基因（ＣＹＰ８２Ｅ４）上游的启动子功能元件作为诱饵，使用酵母单杂交方法从喷 施乙烯利叶片的ｃＤＮＡ融合表达文库中钓取与之相互作用的结合蛋白．研究结果表明，诱饵载体ｐＨＩＳ２／ ｐＥ４ 和 ６ － × ｃＤＮＡ融合表达载体ｐＧＡＤＴ７ Ｒｅｃ２共转化到酵母细胞中的效率为１ １０ ．对文库的筛选结果表明，本研究共获 得３９个阳性克隆，且阳性克隆的插入片段在８５０～２５００ｂｐ之间．将获得的３９个阳性克隆进行测序，其中发现１ 个可能参与基因（ＣＹＰ８２Ｅ４）表达调控的锌指蛋白转录因子．下一步将对其功能进行分析，为通过分子育种手段 培养低含量去甲基尼古丁的烟草提供实验基础． 关键词：烟草；去甲基尼古丁基因；ＣＹＰ８２Ｅ４；酵母单杂交 － － － 中图分类号：Ｑ９４６．２　 　 文献标志码：Ａ　 　 文章编号：０２５８ ７９７１（２０１５）０１ ０１４０ ０７ ［１］ 烟草中生物碱的组成和含量是衡量烟叶品质的重要指标之一，而尼古丁是烟草中主要的生物碱 ．某 些烤烟和白肋烟品种在成熟和烘烤过程中可以将大部分尼古丁转化为去甲基尼古丁，使后者成为含量最 ［２］ 高的生物碱 ．然而，去甲基尼古丁是潜在致癌物质亚硝基去甲基尼古丁（ｎｉｔｒｏｓｏｎｏｒｎｉｃｏｔｉｎｅ，ＮＮＮ）的合成 ［３］ ［４］ 前体 ．鉴于去甲基尼古丁的特殊性质，尼古丁去甲基化及催化该反应的酶编码基因一直是研究热点 ． 从分子水平上阐明烟草中去甲基尼古丁的生成机制始于研究者们对尼古丁去甲基酶（Ｎｉｃｏｔｉｎｅ Ｎ－ ［５］ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ，ＮＮＤ）基因的克隆与功能分析．Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙ 等 最先发现催化烟草尼古丁去甲基化的关键酶是 ［６］ 由属于ＣＹＰ８２Ｅ２亚家族的细胞色素 ＣＹＰ４５０ 基因编码．随后，Ｇａｖｉｌａｎｏ 等 通过 ＲＮＡｉ 技术抑制白肋烟 ＣＹＰ８２Ｅ４及其同源基因的表达，研究结果表明转基因植株的去甲基尼古丁转化率最低只有０．８％．此外，对 ＣＹＰ８２Ｅ４基因启动子的分析结果表明，ＣＹＰ８２Ｅ４ 在根中表达水平极低，而在衰老叶片和花器官中高水平 ［７］ 表达，且该基因的表达受到乙烯的强烈诱导 ．由此可见，阐明乙烯或衰老对 ＣＹＰ８２Ｅ４基因表达调控的分 子机制是通过分子育种手段培