API2抑制胃癌细胞株SGC7901生长及其机制的探讨.docVIP

API2抑制胃癌细胞株SGC7901生长及其机制的探讨 　　[摘要] 目的 检测不同浓度API2作用后磷酸化AKT(pAKT)在胃癌细胞株SGC7901中的表达及细胞生长情况,并探讨Akt信号转导通路与消化道肿瘤发生发展的机制。方法 胃癌细胞株SGC7901传代培养;MTT方法检测不同浓度API2 (0,2,4,6,8 μmol/L)对胃癌细胞SGC7901的增殖抑制作用;免疫细胞化学染色和Western blot检测经API2作用24 h后胃癌细胞株SGC7901中pAKT的表达。结果 不同浓度 API2 均可抑制SGC7901细胞的增殖,并呈浓度和时间依赖性;不同浓度 API2 作用24 h 后,pAKT 蛋白表达均减少。结论 API2作用Akt信号转导通路的位点,减少pAKT的表达。Akt信号转导通路与胃癌细胞株SGC7901的发生、发展有关。? 　　[关键词] Akt信号转导通路;胃癌细胞SGC7901;Akt 　　 　　传统的观点认为肿瘤的发生是癌基因激活和抑癌基因失活所致,近年来的研究发现,许多癌基因和抑癌基因相关产物为细胞生长、增殖、分化等信号转导途径的成员[1]。因此,新的观点认为,细胞癌变是由于信号转导途径异常,细胞接受了异常生长、增殖、分化信号所致[1]。Akt,也称为蛋白激酶B(protein kinase,PKB),是一种原癌基因,因其与致小鼠白血病病毒癌基因vAkt高度同源而得名[2,3],由于处在细胞内多种信号途径的交叉口,因此Akt在各种肿瘤发病机制的研究中越来越受到关注,国内外对其在胃癌中的作用均有研究[4,5]。活化的AKT(pAKT)通过磷酸化mTOR、Bad、GSK3、mdm2、caspase家族、Forkhead家族等多种作用底物,在促进肿瘤细胞的生长、增殖,抑制细胞凋亡,促使细胞侵袭和转移,促进血管生成,抵抗化疗和放疗中细胞的凋亡等方面起重要作用[6]。Akt抑制剂II(Akt Inhibitor Ⅱ,API2)是目前明确的Akt通路小分子抑制剂,能有效地选择性抑制肿瘤细胞中过度表达的Akt,从而抑制细胞生长及促进细胞调亡[7]。目前,国外相关实验大部分使用API2用于干涉乳腺癌等生长研究,较少见于消化道肿瘤的研究,本研究使用API2选择性抑制Akt信号转导通路中Akt位点,结合SGC7901细胞生长情况,以及检测pAKT的表达水平,探讨Akt信号转导通路与消化道肿瘤发生发展的机制。? 　　 　　1 材料与方法? 　　 　　1.1 材料 人胃癌细胞株SGC7901来自本实验室传代培养,胎牛血清购自杭州四季青公司,RPMI1640购自GIBCO公司。API2(Akt Inhibitor Ⅱ)购自MerckCalbiochem公司。四甲基偶氮唑蓝〔3(4、5dimethylthiazol2YL)2,5diphenyl tetrazolium bromide,MTT〕与二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)均购自Amresco公司。兔抗人pAKT1/2/3(Ser473)多克隆抗体购自Santa Cruz公司。即用型SP免疫组化试剂盒(PV9000)与DAB显色试剂盒均购自北京中衫金桥生物公司。Western blot试剂盒购自美国KPL公司。GAPDH抗体购自碧云天公司。酶联免疫检测仪为美国BIOTEK公司产品,型号:ELX 800。电泳仪型号:DYY6D,半干转印槽型号:DYCP40C,均为北京六一公司产品。? 　　1.2 方法? 　　1.2.1 细胞培养 SGC7901细胞接种含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,置37℃、5%CO?2培养箱中培养,按常规胰酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。? 　　1.2.2 增殖抑制实验 　　SGC7901细胞以每孔5×10?3个接种于96孔培养板中,每孔体积100 μl。API2用DMSO溶解,并调整DMSO终浓度为0.06%。用0、2、4、6、8 μmol/L API2分别处理24、48、72、96 h后,每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,培养箱中继续孵育5 h,终止培养。弃上清液,每孔加入150 μl DMSO溶解,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。以0 μmol/L API2组为对照组,计算增殖抑制率,增殖抑制率=〔(对照组吸光度值实验组吸光度值)/对照组吸光度值〕×100%。? 　　1.2.3 免疫细胞化学染色 方法按即用型SP免疫组化试剂盒说明进行。六孔板上放置载玻片接种细胞,4%多聚甲醛固定30 min,0.3%曲拉通破膜30 min,3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性,滴加兔抗人pAKT1/2/3(Ser473)多克隆抗体4℃