elisa检测技术 ppt课件知识讲稿.pptVIP

酶联免疫吸附试验 (ELISA) ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用 ELISA的基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 基本原理 ELISA试剂盒的组成 完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）；（7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。 酶标板 ELISA常用酶类 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) DH2+ H2O2 D + H2O　　上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。 常用底物： 1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为 黄色（450nm检测）。 反应终止液：HCl或H2SO4溶液。 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP) 常用底物： 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为黄色的对硝基酚 （405nm检测）； 2. 发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于荧光测定，灵敏度高于显色底物的方法。 反应终止液：NaOH 溶液。 ELISA所需仪器设备 恒温箱 洗板机 酶标仪 ELISA的类型和方法 半定量ELISA试验 定量ELISA试验 试验目的 试验性质 间接法 双抗夹心法 (直接夹心法) BAS-ELISA 双夹心法 (间接夹心法) 竞争法ELISA 直接法 直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量（见后图） 。该方法可用于检测抗体或抗原。 直接法ELISA 优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。 缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。 间接法ELISA 间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。 该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的ELISA方法。 优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价格便宜。 双抗夹心法ELISA 双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量，本方法也称为直接夹心法（见后图） 。 该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细菌、病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法。 优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制备方便，价格便宜。 双夹心法ELISA 双夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-未标记抗体复合物；再应用酶标二抗和抗体-抗原-未标记抗体复合物结合，形成抗体-抗原-未标记抗体-酶标二抗复合物，也称为间接夹心法（见后图）。 该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。 优点: 1. 灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。 缺点: 实验操作较复杂。 BAS-ELISA BAS-ELISA即生物素-亲和素系统（biotin avidin system, BAS）ELISA法