亲水的作用―反相二维液相色谱串联质谱法鉴定水稻蛋白质.docVIP

亲水的作用―反相二维液相色谱串联质谱法鉴定水稻蛋白质 　　摘 要 建立了亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质组学的方法。利用标准肽段系统分析了液相色谱流动相酸碱度对二维亲水作用-反相色谱系统正交性的影响。结果表明， 第一维亲水作用色谱在碱性 （pH 9.3） 和第二维反相色谱在酸性 （pH 3.3） 的条件下，正交性最佳（R2=0.34113）。在此基础上，结合馏分收集技术进一步评价了本测试系统在水稻叶片蛋白质分析中的正交性。结果表明，在所有馏分收集组分中，鉴定次数小于2次的水稻叶片肽段占总肽段数目的50%以上，且一维液相色谱馏分收集的肽段在第二维色谱及质谱分离分析中，可以较好地分布在不同时间段的洗脱窗口，表明本研究建立的亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱结合馏分收集技术在复杂水稻叶片蛋白质分离鉴定中可提供良好的的分离正交性。结合水稻蛋白质数据库检索，共鉴定出207345个肽段，归属于2930个蛋白质簇。 　　关键词 亲水作用-反相二维液相色谱； 蛋白质； 水稻叶片； 纳升级液相色谱串联质谱； 正交性 　　1 引 言 　　水稻作为重要的粮食作物，是全球超过一半以上人口生存的食物来源，深入了解水稻生长发育过程及调控具有重要意义[1]。蛋白质作为基因功能的最终表现者和生物体性状的直接参与者，在蛋白质水平研究水稻发育生物学更具有直接性[2，3]。目前，植物蛋白质组学的分离分析主要分为双向电泳技术 （2-DE） 和多维液相色谱技术[4，5]。双向电泳技术是经典的蛋白质组学研究方法，但是其本身具有对分离极酸、极碱等蛋白的限制和无法与质谱直接联用等不足，而近年出现的基于液相色谱-串联质谱技术逐渐在蛋白质组学研究领域发挥越来越重要的作用[6，7]。多维液相色谱主要通过不同维数色谱对肽段的保留机制差异，提高分辨率及增加系统峰容量，改善复杂样品的分离分析[8]。因此，选择合适的色谱类型组合是建立多维液相色谱系统的关键。现已建立的多维液相色谱主要是二维液相色谱，如离子交换-反相色谱[9]、反相-反相色谱[10]、亲水作用-反相色谱[11]等。离子交换-反相色谱 （SCX-RP） 具有良好的正交性，是最早应用于蛋白质组学研究的二维液相色谱。但是，大多数肽段所带电荷量相似 （+1、+2、+3），导致保留能力相似，分离效率较低，此外脱盐过程也会有蛋白损失。这些因素都使得SCX-RP在蛋白质组学分析中存在局限[9，10]。研究表明，除选择不同的固定相外，改变流动相酸碱度也可实现二维液相色谱对肽段保留的差异，例如二维反相-反相色谱 （RP-RP） 通过色谱间急剧变化的流动相酸碱度，实现肽段电荷分布差异，进而实现肽段选择性分离分析[12]。 　　由于二维反相-反相色谱均通过疏水性实现对肽段的选择，反相-反相系统在复杂肽段分离中不能提供良好的正交性[12]。依据对肽段的不同保留机制和对复杂体系高效的分离能力而建立的亲水作用-反相色谱 （HILIC-RP）为多维液相色谱分离技术开创了新的思路[13，14]。Chen等[15]采用在线亲水色谱-反相色谱分析大肠杆菌溶菌酶蛋白质组学。亲水作用-反相色谱已广泛应用于人类及动物体蛋白质组学的分析，但在植物蛋白质领域应用较少，主要是由于植物体本身的次生代谢物等杂质一定程度上干扰色谱分离[16]。至今尚未见将亲水作用-反相色谱应用于水稻器官或组织水平的蛋白质组分析的相关报道。 　　近年来，在复杂的蛋白质组学实际样品分析中，馏分收集技术被广泛应用于反相-反相二维液相色谱系统，提高了系统分离正交性[17，18]。首先将复杂样品经过一维色谱预分离出多组馏分，各组馏分按照一定的组合方式 （如时间方式） 组合，再进行第二维色谱及质谱的分析。Dwivedi等[17]将馏分收集技术应用到反相-反相二维液相色谱，提高了系统正交性，蛋白质的鉴定量增加了近30%。此外，馏分收集技术的引入，解决了由低碱度肽段的信号抑制和低丰度蛋白的采样过疏等引起的重现性降低的问题[19]。 　　本研究建立了亲水作用-反相色谱分离-串联高分辨质谱的方法，应用于水稻叶片蛋白质组学分析。利用特征标准肽段系统考察了各维液相色谱在不同酸碱度条件下对二维液相色谱系统分离正交性的影响。此外，由于水稻叶片中蛋白复杂，馏分收集的引入可进一步降低由质谱数据依赖模式扫描对蛋白质的覆盖，提高鉴定重现性，为获得更全面的水稻叶片中蛋白质种类的研究奠定了基础，以促进蛋白质组学对水稻器官发育调控机理等方面的研究，为植物性蛋白质组学研究提供技术参考。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱系统用于标准肽段评价二维亲水作用-反相色谱系统的正交性，包括1260高效液相色谱仪、6545 四极杆飞行时间液相色谱-质谱联用系