云南金钗石斛居群DALP遗传变异的研究.docVIP

云南金钗石斛居群DALP遗传变异的研究 　　[摘要] 对云南7个金钗石斛居群和1个喇叭唇石斛居群，用5组DALP引物扩增得到140条清晰条带，其中102条为多态位点，多态比率72.86%，平均每组引物扩增所得多态条带为20.4。金钗石斛居群水平平均多态位点47.96%，多态位点在22.86%～68.57%；物种水平多态位点72.86%。DALP分析显示，金钗石斛物种水平的遗传多样性指数分别为PPB 72.86%，H 0.288 9，I 0.424 2；居群水平遗传多样性指数分别为PPB 47.96%，H 0.186 1，I 0.273 9。金钗石斛基因遗传分化系数Gst为0.338 6，即66.14%的遗传变异来自居群内，33.86%的遗传变异来自居群间，居群间存在较高水平的遗传分化。 　　[关键词] 金钗石斛； DALP； 遗传多样性 　　[收稿日期] 2013-03-14 　　[通信作者] 虞泓，教授，Tel：（0871）Fax：（0871）E-mail：herbfish@163.com，hongyu@ 　　金钗石斛Dendrobium nobile Lindl多年生草本，为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium Sw植物。生于海拔500～1 700 m的山坡林中树上或路边岩石上。主要分布于云南、贵州、四川、湖北、广西、广东，海南岛和台湾等地[1-2]。金钗石斛为常用珍贵中药，在《神农本草经》中列为上品，具有滋阴清热，生津益胃，润肺止咳，明目强身等功效。现代药理学研究表明，石斛还具有抗肿瘤，抗衰老，增强机体免疫力，扩张血管及抗血小板凝集等作用[3-5]。在我国药典收载的5种石斛中，金钗石斛生物碱含量最高[6]。同时石斛在国际花卉市场上占有重要地位，具有很高的商业价值[7]。 　　Direct amplification of length polymorphisms （DALP）以通用测序引物M13为核心序列，在此基础上任意添加少数碱基形成引物，对样品基因组进行PCR扩增，得到相应的DNA指纹[8]。相比RAPD等分子标记，DALP包含了更多的信息量，有更高的可重复性和稳定性，是揭示生物居群遗传多样性及其遗传结构快速、有效、重复性好的可靠方法，适合于检测居群间和居群内的遗传变异[9]。DALP分子标记在物种鉴定、遗传多样性分析、系统与进化等研究得到广泛应用，可用来判断植物类群的分类地位、习性、交配系统、种子扩散机制、分布地区和演替阶段，对居群遗传分化程度的影响；近些年还被广泛应用于中草药植物遗传分析和药材鉴定，寻找中药材品种之间的遗传差异性[10-16]。 　　近年来，由于长期过度的开发，金钗石斛生境破坏和退化，加之生长缓慢等原因，金钗石斛也逐渐变为稀少。本研究试图利用DALP标记，对云南金钗石斛居群进行遗传结构和遗传分化分析，为金钗石斛种质资源的保护与可持续利用提供依据。 　　1 材料 　　金钗石斛7居群共83个个体分别采自贡山、景洪、思茅、腾冲、保山、屏边、文山等地区。以采自腾冲的喇叭唇石斛D.Lituiflorum居群10个个体，为比较。除景洪和思茅的部分个体外，试验所用样品均引种至云南昆明官渡区小哨乡白汉场英茂生物技术实验室基地（海拔2 100 m）。样品来源、编号和生境情况，见表1。 　　表1 金钗石斛和喇叭唇石斛居群的材料来源 　　Table 1 Origin of Dendrobium nobile and D.lituflorum 　　2 方法 　　2.1 金钗石斛的总DNA的提取 基因组DNA提取采用CTAB法[17]，并稍作修改。0.5 g左右的植物叶片放到研钵中，加入适量PVP和2% β-巯基乙醇迅速研磨成糊状，然后加入4 mL预热到65 ℃的2×CTAB（含2% β-巯基乙醇）中，65 ℃水浴1 h，冷却，加入1/3体积5 mol?L-1的KAc冰浴1 h，4 ℃ 7 000×g离心3 min，取上清，CI（氯仿-异戊醇 24∶1）抽提2次，取上清加 3/4 体积的异丙醇，-20 ℃静置30～60 min，12 000×g离心10 min，70%乙醇洗2次，无水乙醇洗1次。加400 μL 1×TE，室温静置2 h，使DNA 充分溶解，1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，用λDNA（25， 50， 100 mg?L-1）标定，利用Kodak 1D分析软件分析并标定到20 mg?L-1备用。 　　2.2 PCR扩增 反应体系：采用20 μL反应体系，其中模板DNA 60 ng， 2 μL 25 mmol?L-1 MgCl2，2 μL 10×Buffer， 1 μL 2.5 mmol?L-1 dNTPs （上海生工分装），4