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扫描电镜技术 目前扫描电镜的分辨力为6~10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm 的光点，则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X 可以直接观察标本表面的三维形态 分辨率不如透射电镜，多用于细胞整体和组织 Scanning electron microscope（ SEM） 人类血细胞 酵母 人类精子 X射线衍射技术 用衍射图分析分子的内部结构，所用射线的波长必须小于分子内原子的距离 X射线的波长约为0.1nm,等于氢原子的直径，适合用来研究分子内原子的排列，高分辨率的电镜也无能为力。 具有比电子更强的穿透力，可以分析较厚的样本 不需要真空，可以分析含水份的样本，避免样本在制作中失真。 使用分子整齐排列的蛋白质晶体是研究分子结构的必备条件 晶体可以增加受到照射是散发射线的总量 研究分子结构的困难在于获得高质量的晶体 X衍射是确定分子内原子排布的唯一方法 核磁共振技术 核磁共振光谱仪（NMR）早期用于小分子结构分析 现在NMR可以研究蛋白质和RNA的三维结构以及糖蛋白中复杂的糖侧链结构 可以研究蛋白质分子间的相互作用 不需晶体，可以用蛋白质的浓缩溶液测定 膜片钳记录 用微电极测定膜的小领域内通道蛋白的离子转运功能 唯一即时研究单一蛋白质分子功能的技术 可以通过研究因离子浓度变化而发光的蛋白质分子指示剂来研究离子浓度的变化 向细胞内导入分子的方法 微量注射 电休克 脂质体转染 磷酸钙转染 葡聚糖转染 细胞的分离 目的从含有多种细胞的组织中获得单一类型的细胞 制备细胞悬液，用蛋白酶水解或金属离子螯合剂（乙二胺四乙酸，EDTA）螯合钙离子 分离特定细胞 单一细胞培养 单一细胞分选方法 通过细胞的大小、形状和密度不同离心分选 对特定材料（玻璃、塑料）的吸附能力不同吸附分选 通过抗体亲和表面分选 流式细胞仪流动筛选 细胞分离技术－离心技术 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。 转速为10~25Kr/min 的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。 差速离心 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器 细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。 通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 这类分离分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。 分离细胞介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH 中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒,密度梯度离心常用介质：氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 速度沉降 主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不 同的速度沉降而达到分离。 平衡沉降 适用于分离密度不等的颗粒，与大小形状无关 细胞或细胞器在连续密度梯度的介质中经大离心力和长时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 需要高速或超速离心，离心时间也较长，对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤 适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 流式细胞术 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群。 包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪 细胞培养 细胞培养是从活体组织分离某一特定的细胞，在一定的条件下培养，使其继续生存、生长、增殖的方法 细胞培养中必须严格无菌 细胞系可以冻存与复苏 细胞的几个概念 原代培养 （primary culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10 代以内）停止生长，需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。 细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50 代左右，在培养过程中其特征始终保持。 细胞系