靶向axl抗体的制备与鉴定-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 中文摘要 1 HYPERLINK \l _bookmark0 英文摘要 4 HYPERLINK \l _bookmark1 英文缩写 7 研究论文 HYPERLINK \l _bookmark2 靶向 Axl 抗体的制备和鉴定 HYPERLINK \l _bookmark3 前言 9 HYPERLINK \l _bookmark4 材料与方法 13 HYPERLINK \l _bookmark5 结果 22 HYPERLINK \l _bookmark6 附图 27 HYPERLINK \l _bookmark7 讨论 41 HYPERLINK \l _bookmark8 结论 44 HYPERLINK \l _bookmark9 参考文献 45 HYPERLINK \l _bookmark10 综述 靶向 Axl 药物在癌症治疗中的研究进展 49 HYPERLINK \l _bookmark11 致谢 59 HYPERLINK \l _bookmark12 个人简历 60 中 中 文 摘 要 PAGE 10万方数据 PAGE 10 万方数据 靶向 Axl 抗体的制备与鉴定 摘 要 目的：受体酪氨酸激酶作为细胞跨膜蛋白，在恶性肿瘤细胞的信号转 导中发挥重要的作用，参与调节细胞生长、分化、粘附、增殖和迁移等多 个生理过程。因此受体酪氨酸激酶是癌症治疗和药物研发的热门分子靶 点。Axl 是受体酪氨酸激酶 TAM 家族成员之一，Axl 及其配体 Gas6 在许 多恶性肿瘤中都有高表达。近年来，Axl/Gas6 作为癌症治疗的新靶点引起 了广泛关注。单克隆抗体药物以其特异性强、安全性高、毒性低、临床疗 效好等优点，在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用。针对 Axl 靶点开发特异性 候选抗体药物，将为肿瘤临床治疗提供更多选择。 方法：本研究通过杂交瘤技术制备靶向 Axl 功能性单克隆抗体。借助 生物信息学、结构生物学对 Axl 胞外段进行序列、结构分析，将 Axl 参与 与 Gas6 相互作用的功能域基因克隆到 pGEX-4T-1 表达载体中，构建重组 质粒，并转化至大肠杆菌 BL21 中，以 IPTG 诱导、表达并纯化获得目标 蛋白。利用目标蛋白免疫 BALB/c 小鼠，经过细胞融合、杂交瘤细胞克隆 化培养，利用 ELISA、流式细胞术、Western 印迹等实验进行抗体筛选； 钓取目标抗体基因，进行基因序列比对分析；进一步通过竞争 ELISA、抑 制增殖、划痕实验、迁移实验等实验评价抗体体外生物学活性。 结果： 1、抗原的制备 对人 Axl 胞外段进行序列、结构分析，结果提示 Axl 胞外区的 Ig-like-C2-type-1(27-128aa)为 Gas6 识别的功能域。将包含 Axl 全长中第 27-128aa(F1)的基因克隆到表达载体 pGEX-4T-1 中，构建 pGEX-4T-1-F1 表达质粒并转化大肠杆菌 BL21 感受态细胞，优化后获得 GST-F1 可溶性 表达并亲和纯化；经 SDS电泳和 Western 印迹等实验方法鉴定， 表达纯化获得的蛋白为预期的 GST-F1 融合蛋白，为免疫动物制备单克隆 抗体奠定了基础。 2、抗 Axl mAb 的制备、筛选和鉴定 GST-F1 融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠后进行杂交瘤融合，以 GST-F1 融合蛋白进行 ELISA 筛选，同时以 GST 蛋白进行负性筛选，挑取特异性 识别 GST-F1 而不与 GST 蛋白结合的抗体克隆。进一步结合流式细胞筛 选，最终获得 2 株稳定分泌抗 Axl mAb 的杂交瘤细胞株（8-11，16-7）。 扩大培养杂交瘤细胞 8-11、16-7，制备小鼠腹水，经纯化获得抗体。利用 小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒分析，显示 2 株抗体株抗体的重链亚类为 IgG3，轻链为κ型。ELISA 结果显示，筛选得到的 2 株抗 Axl mAbs 不仅 可以特异性识别 GST-F1 抗原，同时可以特异性识别真核表达的 Axl 胞外 段与人 IgG-Fc 融合蛋白（Fc-Axl-ECD）；利用 Axl 高表达的细胞株进行 Western Blot 以及流式细胞分析，结果显示筛选得到的 2 株抗 Axl mAbs 可以特异性识别天然表达的 Axl 蛋白。 钓取了 2 株抗体的基因并测得基因序列，所得序列在 GenBank 中与 抗体核酸序列进行比对分析，结果显示 2 株抗体的轻链和重链的可变区序 列与提交的小鼠 IgG 可变区序列的同源性均超过 96%，确定基因序列为