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蛋白质组学 浙江大学 生命科学学院 江 辉 zhedajianghui@163.com 密码：shenghua 蛋白质组学研究思路和技术 第二章 二维电泳与蛋白质分离 一、蛋白质的提取与样品制备 二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、胶上蛋白质检测技术 一、蛋白质的提取与样品制备 从生物材料中获得所需蛋白质样品的过程 意义 蛋白质组分析的基础，也是研究工作第一步 制备的完整性、纯度、浓度对下面分析非常重要 无完全通用技术（技术和大量经验的结合） 包括分离、提取、纯化（分开、结合、省略） 分离：生物样品提取液中的蛋白质与其它大量杂质分开 提取：将已经与其它物质分开的蛋白质提取出来（如沉淀等） 纯化：对提取的蛋白质进一步清除杂质成为纯度高的蛋白质样品（如亲和纯化等） 二维电泳分析中的样品制备（目标蛋白在细胞中的存在方式） 稳定性（热、pH、蛋白酶、化学试剂等） 丰度 定位（膜、细胞质、细胞器等） 溶解性（可溶、微溶、难溶、不溶） 分离难易程度 制备变性、活性蛋白 二维电泳分析中的样品制备 制备原则： 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。 （1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。 （2）不同类型的蛋白质需要不同的方法 （3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。 防止发生化学修饰（加入尿素之后，加温不要超过37°C，以防蛋白质氨甲酰化）。 破坏蛋白质与其它大分子之间的相互作用，形成线性、独立的肽链 样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80°C，不要反复冻融样品。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。通过超速离心清除所有的杂质。 主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 蛋白质制备流程 分离、提取、纯化 分离：组织或细胞破碎 最大程度的细胞破碎 最小程度的蛋白水解或降解 提取：分离或沉淀蛋白质（可选择） 去除杂质（除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等） 冷冻干燥、沉淀（TCA、丙酮）等 纯化：去除无关杂质（可选择） 反复提取 分级提取 样品类型 整体样品：单细胞微生物、微生物混合菌等 组织样品：器官（肝脏）、植物组织（根、叶）等 细胞（细胞器）样品：培养细胞、分离细胞、细胞核、线粒体等 可溶性样品：血清、尿液等 细胞裂解的方法 1、温和裂解的方法:裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。 2、剧烈的细胞裂解方法:破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或有坚韧细胞壁的细胞 蛋白质的分离与提取方法 硫酸铵沉淀 高盐溶液中，蛋白倾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高盐中也可溶 搅拌情况下，缓慢滴加(NH4)2SO4到饱和，离心分离蛋白 三氯乙酸沉淀 10-20％即可沉淀蛋白；再溶解困难 丙酮沉淀 常用方法 加入3倍以上体积丙酮，-20?C沉淀2h以上，离心分离蛋白 三氯乙酸－丙酮沉淀 同时加入三氯乙酸和丙酮， -20?C沉淀，离心分离蛋白；再溶解困难 苯酚提取－甲醇中乙酸铵沉淀 饱和酚提取蛋白，甲醇中用NH4Ac沉淀蛋白，依次用NH4Ac和丙酮洗涤沉淀 裂解液的组成 目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全溶解和变性 组成： IPG缓冲液（IPG buffer）：Tris等 离液剂（Chaotropic Agents） ：硫脲和尿素 去污剂（Detergents）： SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等 还原剂（Reducing Agents）：β-巯基乙醇、DTT或TDF （二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等 两性电解质（Carrier ampholytes） 蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）：PMSF等 离液剂（Chaotropic Agents） 尿素是最常用的离液剂，2mol/L硫脲和5-8mol/L尿素联合使用（硫脲在水中的溶解性很差） 原理： NH2-CO-NH2, NH2-CS-NH2 改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活 破坏了疏水键（防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性） 硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性 使用注意点： 样品离心前在室温下至少保持1小时，使完全变性和溶解；样