补阳还五汤对缺氧损伤神经干细胞bdnf、gdnf表达的影响中医内科学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 目 的: 观察补阳还五汤对缺氧损伤神经干细胞BDNF、GDNF表达的影响。 方 法: ⑴将原代培养的神经干细胞，随机分为4组：空白组、模型组、 补阳还五汤血清组、正常血清对照组，于培养的第2天，取四组培养细胞 各12孔，每孔加入4%多聚甲醛室温下固定30min，3%H2O2-0.1M PBS 20min 以去除内源性过氧化物酶，正常羊血清封闭，37℃孵育1h。将四组各12 孔细胞进一步分成二个亚组，每个亚组六孔细胞，分别加入一抗(BDNF、 GDNF)，37℃孵育1h，经生物素化二抗和辣根酶标记链酶亲和素各1h (37℃) DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗三次终止反应。以上操作除滴加 封闭液后勿洗外，其它各步骤之间均须用0.1M PBS(含0.3%TritonX-100) 洗5min×3次。在40倍物镜下观察缺氧损伤后神经干细胞的形态变化以及 免疫反应阳性物的分布。对于阳性反应物的水平，则按每组6孔细胞，每 孔细胞取5个互不重叠的视野，计算每个视野的阳性细胞数目。并用南京 捷达DP801图像分析系统，分别统计BDNF和GDNF蛋白表达的阳性面积，取 平均值。并进行统计学分析。 结 果: 补阳还五汤血清干预1 d后Nestin、NF-200、GFAP单标免疫细胞 化学发现NF-200阳性细胞比例中实验组最高(66±7)％，与空白组和