提RNA反转的详细流程.docVIP

SMART 技术制备 GS FLX 样品cDNA详细流程 第一天 RNA的提取 用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)： 在1.5 ml管中加入600ulRLT和6ul B-巯基乙醇 取10—30mg组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎， 3—5min 12000rpm/3min,取上清移入新管 加入1倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作) 加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液 加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min 将收集柱移入1.5mlRnase-free管中，加30—50ulRnase-free water,静置1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase去除DNA,需用87.5ul RNA溶液，因此用45ul Rnase-free water洗两次) 9）定量，跑胶 用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除DNA 污染 反应体系：共100ul 87.5ul RNA 溶液 10ul buffer RDD 2.5ul Dn