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PCR技术应用一：诊断单基因疾病 自1987年秋以来，PCR技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携带者的诊断。目前PCR还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实验诊断学家对诊断方法的选择。JohnHopkins大学的研究人员表明，在诊断基因缺陷疾病方面PCR技 术具有快速、准确、操作灵活等特点。每项进展的实例在以后描述。在1987年10月前，我们用Southern印迹法产前诊断镰刀红细胞贫血症通常需要两周或更长时间，而 1987年10月以后，应用PCR只需2-4天。在1987年以前，几乎所有的β－地中海贫血症 的产前诊断都是通过检测在β－珠蛋白簇中连锁DNA的多态间接完成的，一般需要2-4 周。1987年10月以后，用PCR扩增β－珠蛋白基因区后，直接检测致病突变即可完成 β－地中海贫血症的产前诊断。这个方法既增加了准确性，又缩短了时间，一般只需 一周时间。该项改进技术的作用，（1）如果我们不能确定在父母双方中β－地中海 贫血的突变位置，我们还可以在1、2天之内研究β－珠蛋白基因簇中DNA的多态性； （2）通过比较母亲与胎儿DNA序列差别来判断母亲传染的程度。这只是说明PCR对基 因诊断意味着什么的几个例子。以下我们举几个特例具体说明PCR技术的应用： （1）通过扩增产物的打点杂交或限制性内切酶酶解方法确定已知的点突变； （2）通过对扩增产物直接测序来发现已知或未知的突变； （3）通过改变PCR扩增产物的大小或产物不能特异扩增来发现异常缺失； （4）通过对DNA多态性研究来间接诊断致病突变。最后，还将讨论PCR技术的技术性难点、重要控制条件及局限性。 产前基因诊断基础知识 产前基因诊断是逐步发展起来的，而且在不断完善。1978年Kan和Dozy提出应用 与β－蛋白基因连锁的DNA多态性来间接诊断镰状红细胞贫血。此种诊断需要进行家族性研究，以确定父母双方的多态性等位基因类型，此等位基因型是用正常β－珠蛋 白基因及镰状红胞β－珠蛋白基因探知的。家族被调查成员包括夫妇俩的孩子，如没 有孩子，则调查夫妇双方的父母。到1982年，通过利用MstⅡ限制性内切酶方法可以 直接产前诊断是否有镰状红细胞贫血，因为内切酶MstⅡ及其同功酶Cv嗷蛳xnNⅠ不能 在突变位点降解镰状β－珠蛋白基因而可在此位点降解正常βA－珠蛋白基因。这种 改进不需家族调查，就可更准确地进行镰状贫血病的产前诊断。正是这种改进法，使直接而简便地确定致病突变成为可能，这也是我们在所有基因诊断研究中所力求的。 单基因缺陷的诊断是通过对连锁DNA多态性研究及家族研究而确定的。到1988年 底，我们利用这种方法诊断了一些患Duchenne肌营养不良症病人、大多数甲型和乙型 血友病人、所有囊性纤维变性病人及Huntington氏病、神经性纤维瘤和成人多囊肾病人。应用这种技术同时直接发现了镰状红细胞贫血、β－地中海贫血、α地中海贫血 有大多数Duchenne肌营不良症、部分甲型血友病和成视网膜细胞瘤病人的致病突变。几乎所有这些病例中，由于重要的DNA序列是已知的，所以PCR技术在产前诊断、症发 前诊断及携带者发现等方面具有非常重要的价值。 应用PCR技术直接发现点突变 在点突变诊断中，继PCR技术之后可用三种技术一打点杂交、酶切分析及直接测序。John Hopkins大学研究人员应用以下几步来诊断镰状红细胞贫血：（1）将人绒 毛膜样品（CVS）或羊水中得到的胚细胞在2MNaCl，0.1NNaOH溶液中煮沸。（2）应用 PCR技术在β珠蛋白基因5末端扩增一个725bp区，用30个循环，72℃链延伸120。（3）用CvnI酶消化725bp扩增产物。（4）降解的产物进行电泳。（5）EB染色。（6）紫外灯下观察DNA片段，并拍照。 在反应中选择使扩增产物含有两固定CvnI位点的引物。因此，酶解产物至少应可见三条带。每个镰状红细胞的β珠蛋白基因含有一个381bp带，而正常βA珠蛋白基因 经酶结果已积累了大量信息，所以我们倾向选用限制性内切酶法消化经PCR扩增的产物，而不是利用特异寡核苷酸探针经打点杂交来诊断βS突变位置的β突变位置。然而，这种方法的的局限性（也是Southern杂交的局限性）是不能显示包括第六密码子 即βS突变位置的β珠蛋白基因的缺失。因此，一个杂合子个体（含一个βS珠蛋白基因，及一个基因缺失）与患镰刀状红细胞贫血病人（含两个βs珠蛋白基因）酶切片段的条带图形是一样的。所以，在诊断这类病人时，会遇到一些困难，最后只有调查 其双亲才能确诊。如果双亲都是βaβs基因型，这个人可确诊为镰状红细胞贫血症。如果双亲中一个一是βa型，另一个是βaβs基因型，此人诊断为βs杂合子基因型且 βs珠蛋白基因含一个缺失。由于突变引起的疾病具有一定特征，所以，理论上直接 确诊β地中海贫