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实时荧光定量PCR技术的研究进展及的应用 　　作者单位：473058河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院检验科 　　1 研究进展? 　　二十多年前，美国Perkin-Elmer Cetus公司人类遗传研究室Mullis等发明了聚合酶链反应(PCR)技术，这成为20世纪生物医学领域革命性创举与里程碑，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。几年后，世界生物实验室中，PCR技术占据了统治地位，并成为分子生物领域的关键技术。大量特异性PCR产物的生成使许多新的DNA分析方法的使用成为可能，这些分析方法包括下游修饰或互补性产物分析技术。但是，利用传统的PCR技术进行检测鉴定时，需要将扩增反应后的电泳进行分离及染色处理，且不能准确定量，使其应用受到限制。1992年，Higuchi最早提出了实时PCR的设想，它的基本思想是利用荧光染料EB(溴化乙锭)可以插入到双链核酸中受激发光的性质，在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，根据PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。但Higuchi利用的是嵌入荧光染料检测，它只能简单地反映PCR反应体系中总的核酸量，是一种非特异性的检测方法。直到1995年，美国PE公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术，融合了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，以获得特定区段扩增产物定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作，克服了常规PCR技术的诸多难题。1996年美国Applied Biosystems公司推出了成熟的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction.FQ-PCR)技术。实时荧光定量PCR技术的出现，标志着DNA分析领域的又一次革命性飞跃。这种先进技术，是在原PCR方法基础上的又一次进展，使高效的DNA定量、定性分析，以及高灵敏性DNA扩增成为可能。这种创新性的PCR技术可以对DNA扩增过程进行监测。? 　　在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-Ct值。C代表Cycle(循环)，t代表threshold(阈值)，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光定量PCR监测需要专有仪器，能够通过联机收集每个扩增周期的数据。实时荧光定量PCR仪器通过DNA分子中的荧光染色情况进行PCR扩增产物测定。每个PCR扩增周期的扩增产物的荧光测定结果显示为点状曲线。一般而言，荧光扩增曲线可分为三个典型时期：早期背景扩增期、中期指数扩增期以及晚期的平台期。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。? 　　实时荧光定量PCR仪可以使研究人员对DNA扩增情况进行密切监测，间接通过荧光信号测定，观察PCR产物累计情况。? 　　实时荧光定量PCR方法有很多类型及亚型，每种方法均具有特有条件、复杂性及可靠性。所有这些实时荧光定量PCR方法均可按照定量方法被分为两种类型-绝对及相对定量。监测方法选择取决于分析复杂性以及最终结果。? 　　绝对定量可对单一靶序列进行定量检测。检测结果为绝对值(例如：病毒载量copies/ml)。绝对定量FQ-PCR一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量，可以通过化学合成目的基因；或是将PCR扩增产物直接梯度稀释，或是将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数可准确定量，它的优点是稳定、准确。质粒DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可在标准曲线中定出样品的拷贝数。做好标准曲线至关重要，对于RNA样品，标准品最好是体外转录的RNA，如果用cDNA、PCR产物